青蒿素对产后脓毒血症大鼠的治疗作用以及对血浆内毒素水平的影响

青蒿素对产后脓毒血症大鼠的治疗作用以及对血浆内毒素水平的影响

江丽仙

江丽仙(广州医学院第三附属医院手术室广东广州510150)

【摘要】目的观察青蒿素对产后感染脓毒血症大鼠的保护作用并探讨其作用机制。方法采用盲肠结扎穿孔术(cecalligationandpuncture,CLP)制作产后1天的大鼠脓毒血症模型,观察青蒿素对CLP产后大鼠死亡率的影响,ELISA法检测术后2、6、12、24、48和72h大鼠血清内毒素水平。结果青蒿素治疗组大鼠死亡率低于产后感染模型组(P<0.01),CLP术后血清内毒素LPS水平较模型组降低(P<0.05或P<0.01)。结论青蒿素能降低产后脓毒血症大鼠血浆内毒素的释放，降低脓毒血症死亡率，对CLP大鼠具有保护作用。

【关键词】青蒿素血浆内毒素脓毒血症

【中图分类号】R96【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）14-0130-02

Protectiveeffectsofartemisininonpostpartumsepticratsandinfluenceontheplasmaendotoxinlevels

【Abstract】Objective：Toinvestigatethebiologicalactivityandmechanismofartemisininonsepticrat.Methods：Septicmodelwasestablishedbycecalligationandpuncture(CLP)inWistarrats.Artemisininwasadministratedtoobserveditsprotectiveeffectsonsepticrats.Bloodwascollectedtoexamineserumcharide(LPS)after2,4,6,12,24,48and72hbyELISA.ResultsArtemisinin,thetreatmentgroupratsmortalityrateislowerthanthepuerperalinfectionmodelgroup(P<0.01),CLPpostoperativeserumendotoxinLPSlevellowerinthemodelgroup(P<0.05orP<0.05).Conclusion：Conclusion:artesunatecanreducepostpartumsepsisratsplasmaendotoxinrelease,reducesepsismortality,theCLPplaysaprotectiveroleinrats.

【Keywords】artemisininPlasmaendotoxinsepsis

脓毒症(sepsis)是感染因素介导的全身性炎症反应综合症，是产后死亡的重要原因之一。流行病学调查表明，脓毒症的发病率约为住院病人的2-11％，其中重症脓毒症和脓毒性休克患者的死亡率则高达30-60％以上。[1]目前对脓毒症的治疗大多是以抗生素为主的综合治疗,尚缺乏有效的防治措施。青蒿素(Artemisinin，ART)是从植物黄花蒿中分离得到的抗疟有效单体，临床上主要用于治疗耐药的恶性疟疾。曾有研究表明青蒿素及其衍生物对内毒素引起的炎症反应具有一定的抑制作用。本文采用产后大鼠盲肠结扎穿孔术(Cecalligationandpuncture，CLP)建立产后感染脓毒症大鼠模型，旨在观察青蒿素对产后脓毒症模型大鼠的治疗作用，并探讨其相关作用机制。

1材料及方法

1.1动物模型的制备健康(SPF级)产后1天的SD大鼠，体质量180～220g。在Wichterman[2]报道方法的基础上进行改良，复制腹腔感染型脓毒血症。术前禁食12h，用10﹪水合氯醛按15ml/kg的剂量，腹腔注射麻醉大鼠，常规消毒腹部，在下腹部正中央切口，长约2cm，打开腹腔寻找盲肠，小心分离其远端与大肠的系膜，盲肠内如有粪便，则把粪便小心挤向相连的大肠，寻找盲肠与小肠及大肠交界处，用灭菌4号丝线环形结扎，结扎完毕后应仔细检查，保持肠道通路正常。在与肠系膜相对的盲端肠壁浆膜面用9号针头穿刺两次，两个针孔相距约3mm，第1针孔距盲端约3mm，同时在第2针孔处放置一条宽2mm的橡胶引流片，防止伤口愈合，轻轻将肠子放回原处，关闭腹腔，逐层缝合。术后即刻皮下注射生理盐水，补充手术过程中体液的丢失，剂量1ml/100g体质量。观察大鼠一般情况及72小时死亡率。以72h死亡率在70-80％作为理想的脓毒症模型。

1.2采用青蒿素灌胃处理：给药方法：CLP组术后给予0.5%的羧甲基纤维素钠混悬液灌胃处理,剂量为7ML/KG/次,3次/天；ART组大鼠于CLP术后行，青蒿素混悬液灌胃处理。剂量为7ML/KG/次,140mg/KG/D，3次/天。

1.3标本采集：血标本：大鼠用1%戊巴比妥钠40mg/kg麻醉后打开胸腔，暴露心脏，无菌注射器针头刺入右心室，吸取血液1.5-2.0ml待检测。采样时相点：正常对照组大鼠麻醉后直接采集各检测标本；ART组和CLP组大鼠分别于术后2、6、12、24、48和72H心脏取血。

1.4血浆内毒素水平检测，大鼠血浆自然沉淀0.5小时，1000rmp/min离心10min，取上清待检测。检测步骤：取鲎试剂1支，加入,1.25的检查用水，轻轻混匀，分别加100ul鲎试剂稀释液至各检测管：将LPS标准品用检查用水稀释为1.0EU/ML，使用前振荡30分钟，作为阳性对照，阴性对照为检查用水；取阴性对照、阳性对照及血清样本各100ul加于各装有鲎试剂稀释液的检测试管中，将检测试管置于EDS-99细菌内毒素测定系统中进行检测。血浆lps测定值按下式计算：lps测定值=LPS实测值/回吸收率

1.5统计学分析

结果以X±S表示,采用SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析和X2检验，P<0.05为差异显著P<0.01为差异非常显著。

2结果

1在术后12H内,各组动物都处于嗜睡状态,不进食,刺激后可见痛觉反应;其后大鼠渐渐苏醒,但24内精神萎靡;存活的大鼠在48h后开始少量饮水,活动度减少,触觉迟钝;60h后逐渐恢复。术后12h开始出现动物死亡,各组动物的死亡高峰出现在24h,60h后大鼠基本不再死亡。不同时相点各组大鼠的死亡数及72h死亡率见表1。

表1不同时相点的大鼠死亡数

分组时间(小时)死亡率（%）

6122436486072

对照组03111417171785

青蒿素治疗组024777735

※P<0.05，※※P<0.01.VSCLP组

3血浆LPS水平

正常对照组大鼠血浆LPS含量极低;CLP组术后2H血浆LPS水平逐渐升高,于12H达到高峰,其后迅速下降,但至72H仍处于较高水平,ART组大鼠血浆LPS水平在术后亦出现升高,但升高幅度较CLP组为小,尤其在12H和72H两个时相点,血浆LPS水平显著低于CLP组P<0.01)。

表2青蒿素对产后脓毒血症模型大鼠血浆内毒素水平的影响。

时间青蒿素治疗组EU/MLCPL组空白对照组

2h2.78±0.343.13±0.230.18±0.06

8h10.32±2.548.92±1.47

12h28.23±1.45※※39.78±2.67

24h14.12±1.2112.88±1.22

48h12.23±1.0913.12±1.86

72h2.33±0.12※※5.89±0.32

图2青蒿素对产后模型大鼠血浆内毒素的水平的影响

4讨论

[2]脓毒症是机体在感染后发生过度炎症反应所引起的一种复杂的临床综合征，是感染、创伤、休克等临床急危重患者的严重并发症。[3]尽管对脓毒症的病理生理机制已进行了深入的研究，临床大多仍以抗生素为主进行综合治疗，至今仍缺乏确实有效的药物供临床应用。

近年来我国药学工作者从黄花蒿叶中分离到一种具有过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物一青蒿素，主要用于治疗脑型疟疾和恶性疟疾。资料表明倍半萜内酯类化合物具有广泛的生物学活性：如抗孕、抗肿瘤、抗心律失常等，近年的研究发现青蒿素对炎症反应具有一定的抑制作用，但作用机制不清楚。因此本论文通过研究青蒿素对产后脓毒症模型动物的治疗作用，为青蒿素在脓毒症的防治研究提供了理论依据，同时拓宽了青蒿素可能的应用。为青蒿素的老药新用提供了实验依据。

[4]脓毒症的根本发病机制涉及到复杂的全身炎症网络效应、基因多态性、免疫功能障碍、凝血功能异常、组织损伤以及宿主对不同感染病原微生物及其毒素的异常反应等多个方面，与机体多系统、多器官病理生理改变密切相关。

[5]细菌内毒素：研究表明细菌的内毒素可以诱发脓毒症，脓毒症病理生理过程中出现的失控的炎性反应、免疫功能紊乱、高代谢状态及多器官功能损害均可由内毒素直接或间接触发。肠道细菌/内毒素移位：20世纪80年代以来，人们注意到应激发生时导致的机体最大的细菌及内毒素储存库-肠道发生功能失调，进而引起的肠道细菌/内毒素移位所致感染与随后发生的脓毒症及多器官功能不全密切相关。[6]研究表明，严重损伤后的应激反应可造成肠粘膜屏障破坏，肠道菌群生态失调及机体免疫功能下降，从而发生肠道细菌/内毒素移位，触发机体过度炎症反应与器官功能损害。产后机体的免疫状态变化，感染不容易控制，比正常状态下更容易出现脓毒血症。

[7]肠道内细菌和内毒素的移位在脓毒症的发生、发展中起重要的作用。内毒素作为脓毒症的主要病原分子，介导炎症反应细胞活化、导致机体大量释放炎性介质，通过瀑布效应致使炎症反应不断放大和加重。

在本实验中，产后大鼠于术后24小时达到死亡高峰，其内毒素的释放也达到高峰，提示CLP模型大鼠的死亡与内毒素和炎症介质的释放密切相关。而青蒿素处理的CLP动物死亡率显著降低，其血中的内毒素变化规律与CLP组动物相似，但高峰水平均显著降低。以上结果提示青蒿素对CLP产后模型大鼠的保护作用可能与其降低CLP模型动物血中内毒素水平并抑制炎症介质的释放有关。

[8，9]正常肠道中寄存着数目庞大、种类繁多的细菌，其中大肠杆菌等革兰阴性菌不断向肠腔中释放内毒素。正常生理情况下，即便正常的肠黏膜具有良好的屏障功能，也存在少量的内毒素持续进入门脉系统形成生理性的内毒素肠肝循环，但由于肝脏对内毒素具有强大的清除能力，内毒素在肝内即迅速被灭活清除。但是，在严重感染和创伤应激时，如在产后，由于肠黏膜屏障功能的损伤，由肠道进入门脉的细菌和内毒素大量增加，再加上病理情况下肝脏的功能下降，导致进入门脉的细菌和内毒素不能被完全清除而进入体循环，诱发全身性的炎症反应，从而介导脓毒症的发生。

以上的实验建立了稳定的产后脓毒症大鼠模型，研究证实青蒿素对CLP模型大鼠具有显著的保护作用，其机制可能与通过某种途径降低了CLP产后模型大鼠的血浆内毒素水平相关。

参考文献

[1]:FangQ,HuZ,ChenZ,DuanX,etal,Effectofpolyethyleneoxideonrenalhemodynamicsinrabbitswithendotoxinshock,NanFangYiKeDaXueXueBao.2012,32(5):718-21.

[2]:YuZ,ChengBC,ShaoK,etal,Etiologyandtreatmentofnon-thoracotraumaticpneumomediastinum,ZhonghuaYiXueZaZhi.2008,11;88(41):2928-31.

[3]:BaoST,WangSM.Diagnosisandtreatmentof34casesofbluntduodenalinjuries.ChinJTraumatol.2007,10(3):177-9.

[4]:ParkhomenkoIuG.,Sepsis:stateoftheart,diagnosisanddisputableproblemsofclassification].ArkhPatol.2005,67(6):53-7.

[5]:ShliapnikovSA,RybkinAK.Theroleofcefepime,a4th-generationcephalosporin,intreatingpatientswithsurgicalsepsis,AntibiotKhimioter.1999;44(11):34-6.Russian.

[6]:PetrovVP.Ontheproblemsofsepsisclassification].Khirurgiia(Mosk).1999;(10):9-12.

[7]:Pal'tsynAA,TepliakovVG,etal,ThecauseofbenignandmalignantcoursesofinfectionduetodifferentstrainsofPseudomonasaeruginosa].BiullEkspBiolMed.1993,116(10):421-4.

[8]李金宝;邓小明;多器官功能障碍综合征的研究进展[J];实用医学杂志;2007年01期

[9]孙小泉,刘健,陈兵;感染性休克患者血清肿瘤坏死因子-α的测定及临床意义[J];天津医科大学学报;2003年01期

项目基金：广东省中医药局资助项目编号：20121187