液相色谱法检测苦瓜中葫芦素D的含量

液相色谱法检测苦瓜中葫芦素D的含量

高萌萌1，吕王姝2 ，万建建1，韩晔红3

1禹城市人民医院药剂科（山东 德州 251200）2 禹城市市场监督管理局（山东 德州 251200）3河北大学药学院（河北 保定 071000）

摘　　要

目的：建立了能够准确检测苦瓜冻干粉中葫芦素D的检测新方法。方法：应用高效液相色谱法，基于C18固相萃取柱的固相萃取法作为本实验的样品前处理方法，在优化萃取参数后，结合高效液相色谱法，检测苦瓜中葫芦素D的含量。结论：该研究建立的HPLC法测定葫芦素D的含量检测限（LOD，S/N=3）为0.03 μg/mL，定量限（LOQ，S/N=10）为0.099 μg/mL，在1-100 μg/mL范围内该方法的线性相关性良好，其相关系数r2≥0.9999。加标回收率在97.9-99.9%，RSD ≥ 0.7%，日内精密度 ≤ 1.6%，日间精密度 ≤ 8.2%。以上数据表明该方法准确可靠，可应用于苦瓜中葫芦素的分离富集检测。

关键词：固相萃取；苦瓜；葫芦素D；高效液相色谱法

Determination of 5-Hydroxymethylglyoxal in Polygonatum Sibiricum by Tube Tip Solid Phase Extraction-HPLC

GAO Mengmeng1, LvWangshu2, Wan Jianjian1，Han Yehong3

1 Yucheng People's Hospital（Dezhou 251200,China）2Yucheng Market Supervision Administration Bureau（Dezhou 251200,China）3 College of Pharmacy, Hebei University（Baoding 071000,China）

ABSTRACT

Objective :  The new detection method has been developed that combines high performance liquid chromatography. Methods : Solid phase extraction is the sample preparation method for this experiment, and a new detection method has been developed that combines high performance liquid chromatography.  Results: The best extraction parameters detect cucurbitacin D in dried bitter melon powder can optimized. Limit of detection (LOD, S/N=3) and limit of quantification (LOQ, S/N=10) is 0.03 μg/mL and 0.099 μg/mL, respectively. The correlation coefficient R2 ≥ 0.9999 (1-100 μg/mL), and the recovery is 97.9~99.9%, RSD≥0.7%，intreday precision RSD ≤ 1.6%, intraday precision is RSD ≤ 8.2%. The above data indicates that the method is accurate and reliable and can be used to test the inpidual richness of cucurbitacin in bitter gourd.

Key words: Solid phase extraction; Bitter gourd; Cucurbitin D; High performance liquid chromatography

葫芦素是从葫芦科和十字花科植物中提取的一类天然三萜化合物，据报道可在多类肿瘤中发挥抗炎及抗肿瘤作用，可抑制多种肿瘤细胞的生长，抑制其增殖分化[1]。葫芦素按结构差异不同可分为A~S，葫芦素D为主要活性成分之一，在抗肝癌、乳腺癌、前列腺癌等方面具有突出疗效[2-4]。葫芦素D对胃黏膜有一定的刺激性，可能会出现纳差、恶心、呕吐、腹泻等胃肠反应，中毒时会有消化不良的胃肠道反应等症状，严重时可出现肺水肿[5]。葫芦素作用效应与剂量呈正相关，因此，明确苦瓜等葫芦科植物种葫芦素D的含量具有重要意义。

基于葫芦素D的理化性质分析，利用溶剂萃取法[6]、固相萃取法[7

]，QuEChERS法[8]等方法进行样品前处理，液相色谱法[9]、紫外分光光度法[10]、液相色谱-质谱法[11,12]检测含量的方法均有报道。本文为探究葫芦科植物中葫芦素D的含量，以苦瓜为研究对象，基于对葫芦素D具有良好吸附性能的十八烷基硅胶为吸附剂，建立十八烷基硅胶固相萃取-液相色谱法，通过优化萃取参数和检测条件，实现苦瓜中葫芦素D的含量检测，助其标准的完善，确保药物质量，更好服务与肝癌患者的治疗，具有创新意义。

1　实验仪器

实验所用的仪器、型号及生产公司如表1.1所示。

表1.1　仪器及型号

2 实验过程

2.1　色谱条件

经查阅文献所知乙腈水为流动相、甲醇水为流动相均可，在选定C18柱条件下，选用265 nm为检测波长，乙腈水相较于甲醇水基线更平稳，所以先用乙腈-水为流动相。

表2.1　葫芦脲检测色谱条件

2.2C18十八烷基硅胶柱信息

以十八烷基硅胶为填料，通过强疏水作用保留非极性化合物。产品特点：高承载量，强疏水性，可承受较高pH 3。产品参数：粒径40-60 μm，孔径60A，比表面积300 m2/g，C含量16-19%。本实验中选用其它杂化材料、MIL-101、Bi-Mxene等均为实验室自制材料。

2.3　标准溶液配制

标准溶液配置：以精密称取的葫芦素D样品1.0 mg，放入10 mL量瓶中，移液枪移取10ml甲醇，常温超声5 min后得到100 μg/mL的标准葫芦素D溶液封膜阴凉处保存。

苦瓜样品处理：取新鲜苦瓜、洗涤，晾干表层水分，称量并剪碎匀浆，装入表面皿中-80℃冷冻干燥，收集冻干粉末。

样品溶液配置：取0.05 g苦瓜冻干粉品，分别放入离心管，加入25 mL分析纯甲醇，分析纯乙醇，配平，离心5 min，取上清液备用。

葫芦素标准品（中药化学对照品）购自乐美天医药|德斯特生物有限公司，地址：四川成都温江区海科路西段128号5栋。

苦瓜购自保定当地农贸市场。

图2.1　固相萃取流程示意图

3 结果与讨论

3.1　十八烷基硅胶材料

从电镜图3-1可知，C18吸附剂为球型。

图3.1　十八烷基硅胶材料的电镜

3.2　固相萃取参数的优化

3.2.1　吸附材料种类的考察

葫芦素是三萜系非极性化合物，通过分子结构及所含的官能基团分析其可能发生吸附相互作用的吸附剂目前实验室有哪些，有潜在的吸附能力。经分析选出吸附材料进行试验：石墨烯、氟化石墨烯具有较大的比表面积和表面化学性质可调的特性，优异的表面吸附性能，对葫芦素D有一定吸附作用。MIL-101材料（MOFs）[13]是无机金属中心和多齿有机配体通过配位键形成的立体网络结构的多孔晶体材料，具有多孔性、对比表面积、结构阻燃性、有机配体的修饰性等吸附性。C18十八烷硅是最常用的硅基质反相固相萃取柱，通过疏水性作用萃取非极性化合物，其选择性很广[14,15]。由于在水溶液体系中可以保存大部分有机物，对有机物的结构要求不严格。十八烷氧基硅烷具有较高的含碳量和较高的疏水性，可以大大增加样品装载量和回收率，17%的含碳量同时可以承受极端的pH值，更适合提取低浓度的分析物。Bi-Mxene材料具有丰富的羟基，可以和葫芦素结构式中的羰基或羟基通过氢键相互作用。

故本实验在现有材料基础上，考察了十八烷基硅胶、石墨烯、杂化材料、MIL-101、Bi-Mxene等几种材料对葫芦素D的吸附性能，结果如下图3-2。

其过程如下：分别称量50 mg吸附剂，上下两端填装孔径0.22 μm的筛板，制备固相萃取柱各三个，依次通过1 mL甲醇和0.5 mL水活化润洗，分别加入1 mL的葫芦素D标液，以1 mL水：乙醇（90：10，v/v）为淋洗剂，以1 mL乙腈：醋酸（95：5，v/v）的洗脱，收集洗脱液，并用液相色谱仪检测。

从结果分析，所选的几种吸附剂，如图3-2所示，选用C18十八烷基硅胶柱吸附效果好，损失率小于其它吸附剂，偏差最小。C18十八烷基硅胶可以有效吸附葫芦素D，损失率小于0.1%，故确定C18十八烷基硅胶材料为吸附剂，石墨烯由于通透性欠佳问题，造成损失率较大，MOF材料粒径较小，容易发生渗漏。

图3.2　固相萃取吸附剂种类的考察

3.2.2　淋洗剂种类的考察

淋洗剂选择：对供试品溶液进行液相检测，得到含有较多杂质峰的色谱图像，很有必要进一步除去杂质干扰。制作多组经润洗后过1 mL供试品溶液的固相萃取柱（C

18吸附剂），分别以水、水-甲醇（90：10，v/v）、水-乙醇（90：10，v/v）为淋洗剂，将淋洗后溶液用色谱分析可知，三种溶液淋洗损失率相差不大，但是色谱分析表明以水-乙醇90：10为淋洗剂洗下杂质相对较多。在保证葫芦素D不损失的前提下选用1 mL 水-乙醇（90：10，v/v）为淋洗剂。

图3.3　淋洗剂种类的考察

3.2.3　洗脱剂种类的考察

洗脱剂选择：将用水-乙醇（90：10，v/v）淋洗过的C18固相萃取小柱进行葫芦素D的洗脱，以甲醇-醋酸（90:10，v/v）、乙腈-醋酸（90:10, v/v）、乙醇-醋酸（90:10, v/v），甲醇，乙醇，乙腈等六种洗脱剂，经过对比多种比例的洗脱液色谱图像及回收率数据发现，回收率较高的为乙腈：醋酸（9:1, v/v），而且经过进一步分析色谱图得知乙腈：醋酸（9:1, v/v）的洗脱效果最佳，故选1 mL乙腈：醋酸（9:1, v/v）作为洗脱溶剂继续考察。

图3.4　洗脱溶液的考察

3.3　方法学验证

从新建方法的线性范围、准确度、高精密性、回收率、定量限（LOQ）和检测限（LOD）等方面来证明本实验所建新方法的重现性和可操作性。本实验的最大检测限（S/N=3）是0.023 μg/mL，定量限（S/N=10）为0.099 μg/mL。日内精密度不大于1.9%，日间精密度不大于8.2%

取葫芦素D样品用甲醇溶液配制成浓度为1-100 μg/mL标准溶液，经过C18固相萃取，经色谱分析葫芦素D的线性关系，y = 3.8x104x +3.6×103，R2≥0.9999可知线性关系良好。表明建立的新方法可以在线性范围内应用于检测苦瓜中的葫芦素D含量（表3.1）。

取已知含量的3份苦瓜乙醇提出溶液，经精密称定。分别精密制备1 μg/mL，30 μg/mL，80 μg/mL，混合溶液，每个单位质量浓度平行配置三次，按“2. 3”条方法制备供试品溶液，在“2. 1”条色谱条件下进样分析，计算得出平均回收率分别为97.9%，98.4%，99.9%。RSD ≥0.7 % (n =3 )，结果见表3.2，表明此方法准确度良好。

表3.1　固相萃取-液相色谱法方法学参数

表3.2　葫芦素D的加标回收率 (n=3)

3.4　苦瓜冻干中葫芦素D含量检测

取3批苦瓜冻干试样0.5 g，经精密称定后，按“2. 3”条方法制备供试品水溶液，应用外标法以峰面积计算葫芦素D的浓度，结果见表3.3，发现浓度为0.20-0.25 mg/g，由此可以证明此方法可以用于苦瓜中葫芦素的定量检测，色谱图见图3.5。从色谱图可知，葫芦脲色谱响应性较高，5 min 左右既可以出色谱峰，而且色谱峰附近无干扰。

表3.3　葫芦素D的含量 (n=3)

图3.5  葫芦素D色谱图

4结论

将本实验制备得到的C18十八烷基硅胶材料作为固相萃取吸附剂，在优化萃取参数后建立了固相萃取-液相色谱法，并与其它商业化吸附剂的性能相比较，数据显示将使用本实验所建方法对苦瓜中葫芦素D检测时，该方法的回收率较高，可以实现复杂样品基质中葫芦素D的特异性萃取分离。本研究建立的滴管固相萃取-液相色谱法对苦瓜中葫芦素D的检测限（LOD，S/N=3）为0.03 μg/mL，定量限（LOQ，S/N=10）为0.099 μg/mL，在1-100 μg/mL范围内该方法的线性相关性良好，其相关系数R2≥0.9999。加标回收率在97.9-99.9%，RSD ≥ 0.7%，日内精密度 ≤ 1.6%，日间精密度 ≤8.2%。以上数据表明该方法准确可靠，可应用于葫芦素的分离检测，而且重现性良好，具有在葫芦素科植物中多种葫芦素检测种应用的潜力。

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作者简介：高萌萌（1989- ），女，山东禹城，硕士，主管药师，复杂样品前处理及含量测定。