简介：摘要目的构建并拯救增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)标记的EGFP-EV-A71重组病毒。方法利用重叠PCR技术，以pMD19T-SDLY107全长质粒为模板，将2A蛋白酶识别序列加入到结构蛋白VP4的5′端；以pEGFP-N1质粒作为模板，扩增获得EGFP目的片段，将其插入到上述重组质粒中，得到重组质粒pMD19T-107-EGFP。经酶切和体外转录后，转染横纹肌细胞肉瘤(RD)，拯救获得重组病毒EGFP-EV-A71。采用Karber法计算细胞培养半数感染量(CCID50)以测定病毒滴度。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同时间点的病毒复制水平，并绘制病毒复制曲线，比较重组病毒与母本病毒的复制力有无差异。乳酸脱氢酶(LDH)和细胞增殖(CCK-8)实验分别测定被感染细胞的细胞损伤率和存活率。结果包含EGFP的重组EV-A71感染性cDNA克隆被成功构建；转染RD细胞后，出现典型的细胞病变并且表达出较强的绿色荧光；重组病毒与母本病毒具有相似的复制动力学特征和致细胞病变效应。结论成功拯救了EGFP标记的重组病毒EGFP-EV-A71。

简介：摘要目的研究肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)中3D蛋白关键氨基酸突变对病毒增殖的影响，并根据3D三级结构模型推断突变影响病毒增殖能力的可能机制。方法以强毒株SDLY107构建的质粒pMD19T-SDLY107-EGFP为模板，利用定点突变和反向遗传学技术构建病毒突变株，对突变株增殖特性进行测定。同时对3D蛋白三级结构进行预测，根据3D蛋白的结构域功能特性推测突变影响病毒增殖能力的可能机制。结果经过双酶切鉴定和病毒基因测序证实已成功构建两株突变株病毒：EGFP-EV-A71(S37N)和EGFP-EV-A71(R142K)。两株突变株在RD细胞中的增殖速率均明显弱于亲本毒株。3D蛋白三级结构预测模型显示3D蛋白由"手指(finger)"、"拇指(thumb)"和"手掌(palm)"三个结构域构成握杯状右手结构，S37N位于"拇指"结构域，R142K位于"手指"结构域，而"拇指"和"手指"结构域对3D聚合酶的活性以及蛋白的稳定性具有重要影响。结论S37N和R142K突变降低了EV71的复制能力，这两个突变可能是通过改变3D蛋白聚合酶活性和结构域之间的相互作用，进而影响EV71病毒增殖。

简介：摘要目的研究中国地区发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)分离株已上传至GenBank序列中M片段基本特征及该病毒的遗传和进化规律。方法从GenBank中获取2020年6月25日前分离于中国的SFTSV毒株M片段全序，利用BioEdit软件进行多序列比对，MEGA5.0软件构建系统发生树，比较不同型别及不同来源SFTSV核苷酸和氨基酸的同源性。结果在GenBank数据库收集到203株中国地区发热伴血小板减少综合征病毒分离株的M片段全序，其中分离于人的毒株185株，占总毒株的91.1%，分离于蜱的毒株共11株，占总毒株的5.4%，分离于其他动物如羊、鼠、刺猬的共5株，占总毒株的3.5%。系统发生树分析显示中国地区流行优势株为C2基因亚型，占总毒株的42.4%，核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为96.4%～100.0%和94 .5%～100.0%。人源毒株与动物分离株同源性极高，核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为92.5%～100.0%和92.0%～100.0%。结论对分离自中国的发热伴血小板减少综合征病毒分离株优势株为C2型，且存在着多种型别的共循环。SFTSV可能有从C型向J型进行适应性转换的可能。