简介：摘要目的观察氧化应激条件下骨形成蛋白4（BMP4）对人视网膜微血管内皮细胞（hRMEC）的增生和迁移影响。方法将体外培养的hRMEC分为对照组、4-羟基壬烯醛（HNE）处理组（4-HNE组）、4-HNE+BMP4处理组（BMP4组）。4-HNE组细胞培养基加入10 μmmol/L 4-HNE；BMP4组细胞培养基加入10 μmmol/L 4-HNE刺激6 h后，再加入100 ng/ml重组人BMP4。噻唑蓝比色法检测4-HNE、BMP4对hRMEC生存力的影响。细胞划痕实验测定4-HNE、BMP4对细胞迁移能力的影响。实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测对照组、4-HNE组细胞中BMP4 mRNA相对表达量以及对照组、BMP4组细胞中纤维连接蛋白（FN）、层粘连蛋白（Laminin）、α-平滑肌收缩蛋白（α-SMA）、胶原蛋白Ⅰ型（Collagen Ⅰ）、血管内皮生长因子（VEGF）、结缔组织生长因子（CTGF）mRNA相对表达量。蛋白免疫印迹法（Western blot）检测对照组、4-HNE组细胞中BMP4蛋白相对表达量。两组间比较采用t检验。结果与对照组比较，4-HNE组、BMP4组细胞生存力（t=12.73、16.26，P=0.000 2、<0.000 1）、细胞迁移率（t=28.17、37.48，P<0.000 1、<0.000 1）均明显提高，差异有统计学意义；4-HNE组细胞中BMP4 mRNA、蛋白相对表达量明显升高，差异有统计学意义（t=16.36、69.35，P=0.000 1、<0.000 1）。qRT-PCR检测结果显示，与对照组比较，BMP4组细胞中VEGF、FN、Laminin、α-SMA、Collagen Ⅰ、CTGF mRNA相对表达量明显升高，差异有统计学意义（t=10.61、17.00、14.85、7.78、12.02、10.61，P=0.0004、<0.000 1、0.000 1、0.001 5、0.000 1、0.000 4）。结论BMP4可诱导hRMEC的增生和迁移，并可调控hRMEC中血管生成因子和纤维化相关因子表达。

简介：摘要目的探究晶状体上皮细胞焦亡在糖尿病性白内障发生中的可能作用。方法实验研究。选择2020年3至11月就诊于天津医科大学眼科医院行白内障摘除手术的70例（70只眼）患者，收集手术中房水及晶状体前囊膜。根据是否伴有2型糖尿病，分为糖尿病组和非糖尿病组，每组35例（35只眼）。采用Western印迹分析、实时定量PCR和免疫组织化学染色检测晶状体前囊膜Nod样受体蛋白3（NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（caspase-1）、Gasdermin D蛋白（GSDMD）的表达，采用酶联免疫吸附测定法检测房水中白细胞介素（IL）1β和IL-18，并进行两组间比较。主要的统计学方法为独立样本t检验。结果糖尿病组年龄为（70±9）岁，非糖尿病组年龄（71±8）岁，两组年龄及性别分布差异均无统计学意义（均P>0.05）。Western印迹分析显示糖尿病组前囊膜晶状体上皮细胞中NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白的表达水平分别为1.11±0.06、0.95±0.04、0.39±0.03，均高于非糖尿病组的0.81±0.04、0.33±0.11、0.16±0.04，差异均有统计学意义（t=4.38、5.36、4.63，均P<0.05）。实时定量PCR结果显示糖尿病组前囊膜晶状体上皮细胞中NLRP3、caspase-1、GSDMD mRNA水平分别为1.98±0.07、54.36±4.88、6.98±1.18，均高于非糖尿病组的1.38±0.16、15.31±1.51、2.41±0.95，差异均有统计学意义（t=3.49、7.64、3.00，均P<0.05）。免疫组织化学染色显示糖尿病组晶状体前囊膜中NLRP3、caspase-1、GSDMD灰度值亦均高于非糖尿病组，差异均有统计学意义（均P˂0.01）。酶联免疫吸附测定法显示糖尿病组房水中IL-1β、IL-18水平分别为（4.178±0.028）、（20.983±0.018）fg/L，均高于非糖尿病组的（4.063±0.017）、（20.509±0.073）fg/L，差异均有统计学意义（t=20.63、37.21，均P˂0.01）。结论caspase-1介导的晶状体上皮细胞焦亡以及焦亡导致的炎性介质释放可能参与了糖尿病性白内障的发生和发展。

简介：摘要目的观察骨形成蛋白4 （BMP4）对人视网膜微血管内皮细胞（hRMEC）中糖酵解水平的影响。方法实验研究。将体外培养的hRMEC分为正常组、4-羟基壬烯醛（HNE）组（4-HNE组）、4-HNE+BMP4处理组（BMP4组）。4-HNE组细胞培养基中加入10 μmmol/L 4-HNE；BMP4组细胞培养基中加入10 μmmol/L 4-HNE刺激6 h后，再加入100 ng/ml重组人BMP4。采用流式细胞仪检测各组细胞内活性氧（ROS）水平；噻唑蓝比色法检测4-HNE对细胞生存力的影响；细胞划痕实验、Transwell小室法测定4-HNE对细胞迁移能力的影响。采用实时定量聚合酶链反应、蛋白免疫印迹法检测正常组、4-HNE组细胞中BMP4、SMAD同源物9 （SMAD9） mRNA、蛋白相对表达量。采用Seahorse XFe96细胞能量代谢分析仪测定正常组、4-HNE组、BMP4组细胞内糖酵解代谢水平。组间比较采用单因素方差分析。结果正常组、4-HNE组、BMP4组hRMEC内ROS水平分别为21±1、815±5、810±7。与正常组比较，4-HNE组、BMP4组ROS水平显著升高，差异有统计学意义（F=53.40、50.30，P<0.001）。正常组、4-HNE组细胞生存力分别为1.05±0.05、1.28±0.05；迁移率分别为（0.148±0.005）%、（0.376±0.015）%；穿过小孔的细胞数分别为（109.0± 9.6）、（318.0±6.4）个。与正常组比较，4-HNE组细胞生存力、细胞迁移率、穿过小孔细胞数量明显提高，差异均有统计学意义（F=54.35、52.84、84.35，P<0.05）。4-HEN组细胞中BMP4、SMAD9 mRNA相对表达量分别为1.680±0.039、1.760±0.011；与正常组比较，差异有统计学意义（F=53.66、83.54，P<0.05 ）。正常组、4-HEN组细胞中BMP4、SMAD9蛋白相对表达量分别为0.620±0.045、0.860±0.190和0.166±0.049、0.309±0.038；与正常组比较，差异有统计学意义（F=24.87、53.84，P<0.05 ）。正常组、4-HNE组、BMP4组细胞内糖酵解、糖酵解能力、糖酵解储备水平分别为1.21±0.12、2.84±0.24、1.78±0.36，2.59± 0.11、5.34±0.32、2.78±0.45和2.64±0.13、5.20±0.28、2.66±0.33；与正常组比较，差异均有统计学意义（4-HNE组：F=86.34、69.75、58.45，P<0.001；BMP4组：F=56.87、59.35、58.35，P<0.05）。4-HNE组、BMP4组细胞内糖酵解、糖酵解能力、糖酵解储备水平比较，差异均无统计学意义（F=48.32、56.33、55.01，P>0.05）。结论BMP4通过糖酵解诱导hRMEC的增生和迁移。

简介：摘要目的分析和验证结缔组织生长因子（CTGF）刺激对视网膜Müller细胞基因表达谱的影响。方法将体外培养的视网膜Müller细胞分为对照组、CTGF组。对照组细胞采用正常DMEM完全培养基培养；CTGF组细胞采用含有10 ng/ml CTGF的DMEM完全培养基持续培养24 h。收集处于对数生长期的细胞行细胞划痕实验，对比分析两组细胞的细胞迁移率；应用HiSeq测序技术对两组细胞进行全转录组测序，获得生物学大数据，在此基础上分析差异表达的miRNA；通过基因注释（GO）功能显著性富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路显著性富集分析对差异miRNA的功能及信号通路进行分析。基于转录组数据筛选出两组间差异表达倍数位于前10名的基因，分析其基因特征。采用实时荧光定量PCR （qRT-PCR）、Western blot和免疫荧光定性检测对骨形态发生蛋白4 （BMP4）的mRNA和蛋白表达进行验证。结果CTGF组细胞迁移率较对照组明显升高，差异有统计学意义（t=3.453，P＝0.026 ）。对照组与CTGF组之间共有325个差异表达基因，其中上调者152个，下调者173个。GO功能显著性富集分析结果显示，差异miRNA的功能主要分为生物学过程、细胞成分和分子功能3类。KEGG通路显著性富集分析结果显示，差异miRNA表达高度富集在神经系统间信号传递、细胞间黏附以及细胞因子与其受体相互作用等相关的通路。分析两组间差异表达倍数位于前10名的基因，这些差异表达基因参与组织炎症反应及纤维化过程等不同的代谢通路及生物学过程。qRT-PCR、Western blot及免疫荧光定性检测结果显示，CTGF组细胞中BMP4 mRNA及蛋白表达均较对照组明显提高，差异有统计学意义（t=39.490、10.110、5.470，P=0.004、0.001、0.006 ）。结论CTGF通过上调Müller细胞中BMP4的表达而促进细胞的增生和迁移导致组织纤维化并可诱导炎症反应。

简介：摘要血视网膜屏障破坏、神经损伤、新生血管及纤维增生膜形成作为糖尿病视网膜病变（DR）的重要病理改变与多种玻璃体细胞因子的综合作用相关。VEGF主要参与增加视网膜血管通透性和诱导新生血管形成；色素上皮衍生因子则具有降低血管通透性，神经保护功能；IL在介导炎症反应中起关键作用，在缺氧状态下血浆和玻璃体液TNF-α显著升高，诱导炎症反应；多种眼部结构均可分泌TGF-β，是调节细胞增生分化的重要细胞因子；结缔组织生长因子则可促进内皮细胞生长、迁移和黏附。另有多项具体分子机制尚未完全阐明，需继续深入研究DR发生的分子机制。我们相信随着DR发生分子机制研究的深入，DR的早期干预及靶向治疗的效果将日趋理想。

简介：摘要目的观察聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子（PSF）高表达对糖基化终末产物（AGEs）诱导下RPE细胞损伤的保护作用。方法将体外培养的人RPE细胞分为正常对照组（N组）、空白对照组（N+ AGAGEs组）、空载体对照组（Vec+AGEs组）、PSF高表达组（PSF+AGEs组）。N组RPE细胞常规培养；N+AGEs组只做转染处理但不导入任何外源性基因的RPE细胞联合AGEs诱导；Vec+AGEs组、PSF+AGEs组利用转染试剂脂质体2000将pcDNA空载体或pcDNA-PSF真核表达质粒导入RPE细胞联合AGEs诱导。除N组以外，其余3组细胞进行相应的转染处理，24 h后应用150 μg/ml的AGEs刺激72 h。采用HE染色和Hoechst 33258染色观察PSF高表达对RPE细胞凋亡相关形态改变的影响；通过ROS水平检测分析PSF高表达对AGEs诱导的RPE细胞ROS表达的影响；采用MTT比色法检测PSF高表达对RPE细胞生存力的影响；采用Western blot检测PSF不同作用时间及不同剂量对血红素氧合酶1(HO-1）表达的影响。结果HE染色和Hoechst 33258染色观察发现，N组细胞形态饱满，细胞核呈圆形，细胞质丰富，染色均一；N+AGEs组、Vec+AGEs组细胞体积缩小，嗜酸性染色增强，细胞核致密浓染、固缩甚至碎裂；PSF+AGEs组细胞形态尚饱满，细胞浆染色较均匀，细胞核染色均一。MTT比色法检测结果显示，PSF高表达可有效提高RPE细胞生存力，但该作用可被ZnPP有效拮抗，且差异有统计学意义（F=33.26，P<0.05）。DCFH-DA法检测结果显示，与N+AGEs组、Vec+AGEs组比较，PSF+AGEs组细胞中ROS产量下降，差异有统计学意义（F=11.94，P<0.05）。Western blot检测结果显示，PSF蛋白以时间、剂量依赖性的方式上调HO-1的表达水平。PSF蛋白作用24、48、72 h的HO-1相对表达水平较0 h明显升高，差异有统计学意义（F=164.91，P<0.05）。0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μg PSF蛋白作用下的HO-1相对表达水平较0.0 μg明显升高，差异有统计学意义（F=104.82，P<0.05 ）。结论PSF可能通过上调HO-1的表达而抑制ROS产生，从而对AGEs诱导下的RPE细胞损伤发挥保护作用。

简介：摘要目的观察探讨聚嘧啶束结合蛋白相关剪接子（PSF）高表达对糖基化终末产物（AGEs）诱导下人视网微血管内皮细胞（hRMECs）氧化损伤的保护作用及相应分子机制。方法将hRMECs分为正常组、空载组、PSF组、锌原卟啉（ZnPP）组及PSF+ ZnPP组进行实验。正常组细胞使用含有10％胎牛血清、青霉素/链霉素的DMEM培养基，置于37 °C、95％空气、5% CO2的密闭恒温培养箱中培养。空载组细胞采用空载慢病毒感染。PSF组细胞采用过表达PSF慢病毒感染。ZnPP组细胞采用ZnPP （10 mol/L）处理2 h。PSF+ZnPP组细胞采用过表达PSF慢病毒感染后，再用ZnPP （10 mol/L）预处理2 h。后四组细胞辅以AGEs刺激，HE、Hoechst33258染色法和流式细胞法观察PSF高表达对细胞损伤的保护作用以及ZnPP对PSF的拮抗作用。采用Western blot检测细胞中血红素氧合酶-1 (HO-1)、磷酸化（p）细胞外调节蛋白激酶（ERK）、核因子2相关因子2 （Nrf2）的蛋白表达。引入ERK通路的特异性拮抗剂U0126，Western blot验证U0126对PSF蛋白所诱导的HO-1表达的逆转作用。结果HE染色和Hoechst33258染色结果显示，PSF组受损细胞核数较正常组明显增加，较PSF+ZnPP组明显减少，差异均有统计学意义（F=27.5、38.7，P<0.05）。流式细胞法结果显示，PSF组细胞产生的ROS较正常组明显增加，较PSF+ZnPP组明显减少，差异有统计学意义（F=126.4，P<0.05）。Western blot检测结果显示，PSF组HO-1蛋白表达量较正常组、空载组明显增加，差异均有统计学意义（F=70.1，P<0.05）；AGEs处理30、60、120、240 min时pERK的蛋白表达量与15 min时比较，差异均有统计学意义（F=474.0，P<0.05）；PSF+/U0126-组HO-1、Nrf2蛋白表达量较PSF-/U0126-组明显增加，PSF+/U0126＋组HO-1、Nrf2蛋白表达量较PSF+/U0126-组明显降低，差异有统计学意义（F=30.2、489.4，P<0.05 ）。结论PSF高表达可以通过活化ERK通路，促进Nrf2转位入核进而诱导HO-1表达，从而保护hRMECs免受AGEs诱导的氧化损伤。