简介:摘要目的观察新型光敏蛋白PsCatCh2.0转染至视网膜色素变性模型rd1小鼠视网膜1年后视网膜神经节细胞(RGC)对光反应、视网膜炎症及细胞凋亡情况。方法雄性rd1小鼠24只随机均分为rd1实验组、rd1对照组,各12只。rd1实验组小鼠鼻侧角巩膜缘下1 mm处玻璃体腔注射重组腺相关病毒(rAAV)2/2-巨细胞病毒启动子(CMV)-PsCatCh2.0-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)1.5 μl,2周后颞侧角巩膜缘下1 mm处再次注射相同剂量的重组病毒。注射后1年,用膜片钳技术记录表达PsCatCh2.0的RGC对光反应;行免疫荧光染色评估PsCatCh2.0在视网膜中的表达情况;行视网膜铺片染色评估重组病毒的转染效率,并计数RGC;使用苏木精-伊红染色评估内层视网膜厚度;采用蛋白免疫印迹法检测视网膜中核因子(NF)-κB p65的蛋白表达;采用实时荧光定量聚合酶链反应检测各组小鼠视网膜中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)mRNA相对表达量;采用原位末端标记法观察各组小鼠视网膜细胞凋亡情况。组间比较采用单因素方差分析。结果注射重组病毒后1年,表达PsCatCh2.0的RGC产生的电流约为30 pA。PsCatCh2.0-EGFP与RGC呈共定位表达;少量与无长突细胞共定位,几乎不与水平细胞、双极细胞共定位。rd1实验组、rd1对照组小鼠RGC密度、内层视网膜厚度比较,差异均无统计学意义(F=14.35、0.05,P>0.05)。rd1实验组小鼠视网膜NF-κB p65蛋白表达量以及TNF-α、IL-6 mRNA表达均低于rd1对照组,差异均有统计学意义(F=4.61、5.91、5.78,P<0.05)。rd1实验组小鼠视网膜中呈红色荧光的凋亡细胞数量少于rd1对照组,Bax mRNA表达低于rd1对照组,差异有统计学意义(F=7.52,P<0.01 )。结论玻璃体腔注射rAAV2/2-CMV-PsCatCh2.0-EGFP后1年,表达PsCatCh2.0的RGC仍可产生光电流;长期转染表达PsCatCh2.0对RGC无明显细胞毒性作用,也不增加视网膜的炎性反应。
简介:摘要:提升机导轨是完全固定在机器上,挤坏烟条不能及时拿取,需拆卸导轨,维修时间过长,需设计一种S提升机新型导轨,当设备在提升机处挤烟时,利用气缸活塞的运动,当需要拿取导轨内挤坏的条烟时,气缸推动下部导轨张开,从而改变下导轨支架与提升支柱之间的间距,使操作人员能够将输送链排上受损的条烟取出。降低了操作人员的劳动强度,提高了设备工作效率。
简介:摘要目的探讨新型光遗传学工具Channelrhodopsin-XXM2.0 (XXM2.0)、Channelrhodopsin-PsCatCh2.0 (PsCatCh2.0)的光敏感性及动力学特征,分析其是否可用于光遗传学视觉功能的恢复。方法通过分子生物学技术将XXM2.0和PsCatCh2.0的基因片段连接到包含抗氨苄青霉素筛选基因和报告基因的载体pCIG (c)-msFoxn3上,形成新质粒pCIG (c)-msFoxn3-XXM2.0、pCIG (c)-msFoxn3-PsCatCh2.0。将构建的新质粒转染到HEK 293T细胞上,用HEKA膜片钳系统行全细胞模式记录对光反应。在2.7×1016、4.7× 1015、6.4×1014 photons/ (cm2·s)的光强下记录电流大小;在2.7×1016 photons/ (cm2·s)光强下刺激XXM2.0、PsCatCh2.0并让其充分恢复,在Clampfit 10.6软件中分析开放和关闭时间常数;在相同光强下,设置2~ 32 Hz的光脉冲刺激,记录XXM2.0、PsCatCh2.0的响应情况,并在重复光刺激后间隔4000 ms和200 ms来分析电流衰减情况。组间比较均采用独立样本t检验。结果在XXM2.0、PsCatCh2.0序列两端引入限制性内切酶位点EcoRⅠ和EcoRⅤ,酶切后通过T4 DNA连接酶成功构建新质粒pCIG (c)-msFoxn3-XXM2.0和pCIG (c)-msFoxn3-PsCatCh2.0,并转染表达在HEK 293T细胞上。XXM2.0和PsCatCh2.0均表现出光强依赖性,光强越大电流越大。在视网膜安全阈值内的光强6.4×1014 photons/ (cm2·s)刺激下,XXM2.0和PsCatCh2.0仍产生较大电流,分别为(92.8±142.0)、(13.9±5.6)pA;两者比较,差异无统计学意义(t=1.24、1.24,P=0.28、0.29)。XXM2.0、PsCatCh2.0的开放时间常数分别为(23.9±6.7)、(2.4±0.8)ms,关闭时间常数分别为(5 803.0±568.2)、(219.9±25.6)ms;两者比较,XXM2.0开放时间常数、关闭时间常数均较PsCatCh2.0大,差异均有统计学意义(t=7.10、31.60,P=0.00、0.00 )。在响应频率方面,XXM2.0和PsCatCh2.0均能很好地响应32 Hz的高频率脉冲光刺激,并在较长时间(4000 ms)和较短时间(200 ms)间隔的重复光刺激后均保持较小的电流衰减率。结论XXM2.0和PsCatCh2.0均可在对视网膜安全的光强条件下被激活,并都能以较低的电流衰减来响应高频率(至少32 Hz)的脉冲光刺激,均满足利用光遗传学来恢复视觉功能所需的光敏蛋白特性。