简介：目的：研制高效分泌表达枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株。方法与结果：将优化设计的枯草芽孢杆菌MA139β-甘露聚糖酶基因用EcoRI／XbaI双酶切，克隆到诱导型表达载体pPICzoLA中α因子信号肽编码序列的下游，转化大肠杆菌筛选重组质粒，转化毕赤酵母X-33感受态细胞，经Zeocin筛选，获得重组表达菌株X-33／mann。将重组菌株在10L全自动发酵罐中进行高密度发酵培养，甲醇诱导72h发酵活力达到2100U／mL。重组甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃，最适催化pH值为6．0。结论：枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中获得了高效分泌表达，具有开发作为饲料添加剂的潜能。

简介：根据已发表的植酸酶基因phyA序列(GI:4815609和GI:22901877)设计引物,以米曲霉(AsperillusoryaeCohn,编号:ACCC30155)的总DNA为模板,利用PCR扩增得到目的片段.将此片段克隆到表达载体pPIC9K的EcoRⅠ酶切位点构建重组质粒,通过电转化方式将重组质粒转化毕赤酵母(Pichiapastoris).检测结果表明,植酸酶基因在毕赤酵母中得到了表达.

简介：采用PCR方法，根据文献报道的人成骨蛋白-1（OP-1）成熟肽基因序列，设计并合一对引物，从含人成骨蛋白基因的质粒中扩增获得大小的420bp的DNA片段，连接到pGEM-T载体进行测序，证明获得人成骨蛋白成熟肽基因片段，继之以pPIC3.5k为表达载体构建重组表达质粒，并经PCR及酶切鉴定。

简介：目的：利用巴斯德毕赤酵母表达系统表达猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）纤突糖蛋白S。方法：根据GenBank中猪TGEV纤突糖蛋白S全基因设计一对引物，并在5’引物和3’引物中引入EcoRI、NotI酶切位点，2。2kb的目的基因S经PCR扩增后克隆于pBS-T载体，再将S基因经双酶切从T载体切下并与穿梭质粒pPIC9k连接，SalI线性化重组穿梭质粒pPIC9k—S，电转化于毕赤酵母GS115感受态细胞，G418筛选鉴定阳性重组子，经甲醇诱导，SDS—PAGE检测诱导后上清。结果：对pPIC9k—S重组酵母表达载体的测序证实已成功克隆了猪TGEVS基因；重组酵母菌诱导表达后，SDS-PAGE检测结果显示表达产物的相对分子质量为为82×10^3，且S蛋白以可溶性形式分泌表达于胞外。结论：利用巴斯德毕赤酵母真核表达系统成功表达了猪传染性胃肠炎病毒（河北分离株）纤突糖蛋白S。

简介：目的：研究抗人表皮生长因子受体2（HER2）人源化单克隆抗体能否在毕赤酵母中表达,并对表达产物进行结构分析和活性测定。方法：合成抗HER2人源化单克隆抗体的全基因,构建轻重链双表达盒表达载体,转入毕赤酵母中;通过表型筛选和诱导表达实验得到抗体表达工程菌,对表达产物进行分离纯化和活性测定。结果：表达产物存在于表达上清中,摇瓶表达水平达到53.7±2.9mg/L;毕赤酵母表达的抗体的轻重链能够自发通过二硫键装配成正确的抗体结构,其中重链发生了N-糖基化;酵母表达的抗HER2人源化单克隆抗体可以抑制高表达p185erbB2肿瘤细胞SKBR-3的生长,半数有效浓度为0.17mg/L。结论：实现了抗HER2人源化单克隆抗体在毕赤酵母中的表达,为毕赤酵母表达系统成为抗体等人用剂量较大的复杂型糖蛋白的大规模、低成本制备平台提供了基础。

简介：目的：对毕赤嗜甲醇酵母工程菌inu-26高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的条件进行优化，找出最佳的外源蛋白表达条件。方法：在摇瓶优化培养的基础上进行发酵罐高密度培养，优化最佳产酶条件。结果：以葡萄糖为碳源、微量元素添加量100～200mL/L、甲醇浓度1g/L、pH6.0～7.0、诱导时间96h时酶的表达量最高；摇瓶模拟高密度培养表明影响酵母生长的最主要因素葡萄糖和硫酸铵的最佳浓度分别为20～45和11.5g/L；利用培养基F1进行高密度培养优于其他培养基，工程菌生长符合指数生长曲线，细胞生长延迟期为1.36h，比生长速率μ为0.4846h-1。结论：以葡萄糖为碳源，采用葡萄糖-甲醇混合诱导和100%甲醇单一诱导相结合，在菌体鲜重约为280g/L时连续诱导96h，菌体生长良好，不会出现自溶，且酶的表达量最高，为摇瓶培养的3倍多，酶活最高可达540U/mL。

简介：目的：利用毕赤酵母野生型菌株GS115（his4）和突变型菌株GJK01（ura3,ade1,arg4,his4,och1）表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）,并对其活性及糖基修饰情况进行比较。方法：用PCR技术扩增目的基因,引入XhoⅠ、NotⅠ双酶切位点,构建pPIC9-hGM-CSF表达载体,电击转化毕赤酵母GS115和GJK01感受态细胞,得到工程菌;经甲醇诱导,对其表达产物进行糖基分析和生物学活性分析。结果：hGM-CSF在野生型菌株GS115和突变型菌株GJK01中均得到表达,其中野生菌表达的为过度糖基化的糖蛋白,而突变型菌株表达的为低糖化的糖蛋白,且二者均可刺激TF-1细胞的生长,比活性分别为9.79×105和2.21×105U/mL。结论：利用酵母工程菌表达了低糖化的重组hGM-CSF,为其药物研究提供了新的思路,也为酵母的糖基工程改造提供了良好的糖蛋白模型。