简介:目的探讨变形链球菌(S.mutans)荧光素酶(luc)基因报告株构建方法,拟为探讨抗菌剂对多菌种生物膜中S.mutans的作用提供研究基础。方法将S.mutansUA159乳酸脱氢酶(ldh)基因及其上游部分约1100000片段克隆至自杀质粒pFW5-luc的多克隆位点,构建重组质粒.并经酶切和测序证实。采用自然转化的方法,实现重组自杀质粒和S.mutansUA159同源序列的单次交换。结果经过聚合酶链反应(PCR)和测序分析,筛选出具有报告活性的S.mutansldh-luc基因荧光报告株。结论成功构建了S.mutansldh-luc基因荧光报告株。
简介:目的:探讨颞下颌关节与周围重要结构的毗邻关系,为避免在颞下颌关节手术中损伤周围重要结构提供数据支持。方法:选取颞下颌关节完整的颅骨标本43副,用游标卡尺和量角器测量颞下颌关节与其周围重要骨性标志的距离与角度。结果:鼓鳞裂最外侧到棘孔、卵圆孔、茎乳孔的最短距离分别是(22.69±2.02)mm、(27.23±2.07)mm、(17.67±1.76)mm,岩鳞裂最内侧到棘孔、卵圆孔、茎乳孔的最短距离分别是(6.55±1.56)mm、(11.64±1.73)mm、(17.53±1.75)mm,蝶棘根部到卵圆孔、茎乳孔的最短距离分别是(9.53±1.39)mm、(20.08±2.14)mm,关节结节最低点到棘孔、卵圆孔、茎乳孔的最短距离分别是(27.33±2.14)mm、(30.33±2.29)mm、(32.23±1.78)mm,关节结节最低点、棘孔、茎乳孔形成的三角形的三个夹角分别是(73.72±7.24)°、(55.58±6.49)°、(50.70±7.56)°,关节结节最低点、卵圆孔、茎乳孔形成的三角形的三个夹角分别是(62.41±6.88)°、(61.19±5.61)°、(56.40±7.60)°。结论:颞下颌关节周边的解剖位置测量数据可以为颞下颌关节手术提供参考标准,减少或避免手术并发症。
简介:目的:构建pEGFP—N1-Snail真核表达质粒,并进行鉴定,转染SCC25肿瘤上皮细胞,检测其表达。方法:利用RT—PCR方法从SCC9肿瘤上皮细胞中提取Snail基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T—Snail重组质粒,挑选阳性克隆,PCR鉴定后送测序。重组质粒双酶切后与pEGFP—N1真核表达载体连接,构建pEGFP—N1-Snail真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。分别抽提pEGFP—N1及pEGFP—N1-Snail质粒,用脂质体2000转染SCC25肿瘤上皮细胞,RT.PCR检测Snail在该细胞中表达。结果:本实验成功构建了pEGFP—N1—Snail真核表达质粒,并在SCC25肿瘤上皮细胞中表达。结论:本实验结果为进一步研究Snail作为转录抑制因子诱导上皮间质转化提供实验基础。
简介:目的:构建牙本质混合层原位再矿化诱导模型,并从微观形态学角度探讨其矿化效果,为仿生再矿化技术的临床应用提供实验依据。方法采用5mm×5mmⅠ型胶原海绵块作为3D胶原支架,结合电镜观察和傅里叶红外光谱分析技术,快速评估成核诱导物多聚磷酸钠(STTP)和硅酸盐水门汀树脂的仿生矿化诱导潜能。在此基础上,将仿生矿化技术与牙本质粘接程序结合,以STTP作为治疗性底剂应用于酸蚀脱矿牙本质面,在完成常规粘接处理后以硅酸盐水门汀树脂为洞衬剂,构建临床相关的混合层原位再矿化模型。采用透射电子显微镜观察矿化1~3个月后树脂牙本质粘接界面再矿化区域的分布和再矿化程度。结果矿化诱导28d后的3D胶原样本,纤维内可见磷灰石纳米晶体的有序沉积,纤维重现了与天然矿化胶原结构类似的横纹特征。红外光谱分析结果显示,在900~1200cm-1和500~600cm-1区域,矿化胶原基质出现与纯羟基磷灰石特征峰相吻合的吸收峰,提示矿化胶原中形成的无机物是磷灰石。混合层原位矿化诱导1~3个月后,混合层内可见纤维内再矿化现象的存在,纳米晶体在胶原纤维内呈现迭序排列特征。结论在牙体粘接修复过程中,以矿化诱导物STTP和硅酸盐水门汀树脂作为治疗性底剂和洞衬剂,能使混合层内树脂渗透不良的胶原基质发生纤维内矿化。通过混合层原位再矿化模型的成功构建,初步证实仿生矿化技术应用于临床树脂牙本质粘接界面损伤修复的可行性,建立了研究方法学,为仿生再矿化技术的最终临床应用提供充分的科学依据。
简介:目的:构建和鉴定靶向E2F-1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法:体外合成两对互补并编码靶向E2F-1基因的特异性短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)序列和一个阴性对照组的寡核苷酸,克隆到pLKO.1-PURO-U6(AgeI/EcoRI)质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。各组病毒载体转染Tca8113细胞后,运用Real-TimePCR和Western检测三组E2F-1mRNA和蛋白的表达水平。结果:经酶切和测序证明,pLKO.1-PURO-U6-E2F-1shRNA序列正确;转染后,各组慢病毒载体中,第一组质粒感染后的Tca8113细胞中E2F-1基因的核酸电泳条带明显减弱,Western检测出E2F-1蛋白的表达降低。结论:靶向E2F-1基因的shRNA慢病毒载体构建成功,并可特异性沉默E2F-1基因的表达,为研究E2F-1在口腔鳞癌的发生发展中的作用提供了初步的实验基础。
简介:目的:构建大鼠组蛋白去乙酰基转移酶(histonedeacetylase8,HDAC8)基因过表达的慢病毒载体,转染大鼠骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)后观察HDAC8的表达。方法:采用DNA重组技术将HDAC8基因插入到慢病毒表达载体质粒pGC-FU中,重组获得慢病毒载体pGC—FU—HDAC8。重组慢病毒载体经过测序鉴定后,转染293T细胞生产病毒液,用得到的病毒液转染大鼠BMSCs,实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法分析转染前后HDAC8表达情况。结果:测序结果证实HDAC8基因正确插入载体中,成功构建大鼠HDAC8基因过表达载体。大鼠BMSCs转染后HDAC8mRNA及蛋白表达显著上调。结论:针对大鼠HDAC8基因过表达慢病毒载体构建成功,并能有效增强BMSCs中HDAC8基因的表达。
简介:目的探讨细胞分裂周期蛋白6(Cdc6)RNAi慢病毒载体的构建。方法设计5个靶向Cdc6的RNA干扰靶点序列(Target1、2、3、4、5),构建靶向Cdc6的RNA干扰载体和Cdc6过表达载体,共转染293T细胞进行外源筛靶,采用Westernblot检测Cdc6蛋白表达情况,判断不同靶点的干扰效果,选择两条最佳RNAi有效靶点序列,制备靶向Cdc6的慢病毒载体,并将其转染Tca8113细胞,通过Real-timeRT-PCR和Westernblot检测Cdc6mRNA和蛋白表达水平,以MTT法测定Tca8113细胞生长水平。结果成功构建Cdc6siRNA表达质粒及Cdc6过表达载体质粒,经外源筛靶实验显示,相对阴性对照组(NC),Target3和Target4靶点对Cdc6蛋白表达的敲减作用最显著,敲减率分别为69.15%和84.85%。在Tca8113细胞中,与NC组比较,靶向Cdc6慢病毒载体KD1和KD2组Cdc6mRNA表达的敲减率分别为50%和65%;Cdc6蛋白表达水平分别下降65.87%和79.38%;Tca8113细胞生长抑制率分别为25.84%和30.34%。结论成功构建两条靶向Cdc6RNAi慢病毒载体:Target3和Target4。
简介:目的探讨人骨形成蛋白-2(BMP-2)全长基因的克隆,及其真核表达重组子构建方法。方法采用Trizol法从人髁状突骨组织中提取制备总RNA,利用逆转录技术转录出BMP-2cDNA,以其为模版,PCR扩增出BMP-2全长基因,与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接.构建真核表达重组子pcDNA3.1(+)/BMP-2.经酶切和序列分析鉴定重组子的构建情况。结果PCR扩增产物在1200000处有扩增条带.与目的基因大小相符.重组质粒经限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ双酶切后。得到5400000和1200000的BMP-2条带,BMP-2基因已成功克隆且成功与pcDNA3.1(+)连接。结论成功克隆出人BMP-2基因,并构建其真核表达重组子pcDNA3.1/BMP-2,为进一步研究BMP-2的功能、BMP-2基因在骨髓间充质细胞(hMSCs)中表达以及在骨组织工程中的应用研究奠定了基础.
简介:目的:构建含人重组牙骨质蛋白1(recombinationhumancementumprotein1,rhCEMPl)基因的真核表达载体,观察其在酿酒酵母细胞中的表达。方法:采用PCR方法扩增rhCEMPl基因,利用定向克隆技术将rhCEMPl基因插入到中间载体pTeasy中,再进一步转插入载体pWX530。重组的pWX530-rhCEMPl在大肠杆菌DH5a中扩增后,通过酶切电泳鉴定和DNA序列测定所构建的质粒。经鉴定正确的表达载体pWX530-rhCEMPl转入酵母感受态细胞中,酵母经氨基酸营养缺陷型筛选后培养表达。利用聚丙烯酰胺凝胶(SDS—PAGE)电泳和酶联免疫吸附测定(ELISA)分析蛋白表达情况,离子交换层析提纯蛋白。结果:构建的重组质粒成功转入酵母细胞,通过SDS—PAGE和ELISA检测rhCEMPl表达成功。结论:成功构建的含m—CEMPl基因的真核表达载体pWX530-rhCEMPl,并能转入酵母细胞中成功表达。
简介:老年患者牙齿缺失后常因牙槽骨吸收造成传统义齿固位困难,种植修复可有效解决该问题,但口腔局部解剖结构的改变使老年人的人工种植牙表现出其独有的特点。就上颌而言,一方面上颌牙槽突、上颌结节、牙槽骨壁等部位随着牙齿缺失及其他局部或全身因素的影响会发生不同程度的萎缩和吸收,种植体与牙槽突长轴、鼻腔、上颌窦的位置关系变得更加复杂,加大了种植治疗的难度;而另一方面尖牙支柱、颧骨区等特殊结构或部位的骨质虽然也发生了萎缩和吸收,但这些结构的解剖特点决定了其可以作为种植体的植入位点,从而使牙槽骨严重萎缩老年患者的种植修复成为可能。充分认识老年人失牙后口腔颌面解剖结构的变化特点,不仅可以最大限度的避免种植并发症的发生,还可以扩大牙槽骨严重萎缩老年无牙颌患者的种植适应证,造福广大老年患者。本文针对我们在临床应用上颌牙槽突、上前牙牙长轴、牙槽骨壁、鼻腔、上颌窦、尖牙支柱、颧骨及上颌结节的解剖特点及增龄性变化完成不同类型人工种植修复的实际情况,结合文献,对这些解剖结构变化与种植的关系进行论述,探讨其作为老年患者种植基础的条件及可行性,供同行参考。
简介:目的:构建大鼠特殊富含AT序列结合蛋白2(specialAT-richbindingprotein2,Satb2)基因过表达的慢病毒载体,转染大鼠骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)后观察Satb2的表达。方法:采用DNA重组技术将Satb2基因插入到含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒表达载体质粒GV208中,获得重组慢病毒载体GV208-Satb2。重组慢病毒载体经过测序鉴定后转染293T细胞生产病毒液,用得到的病毒液转染大鼠BMSCs,Westernblot分析转染前后Satb2表达情况。结果:测序结果证实Satb2基因正确插入载体中,成功构建大鼠Satb2基因过表达载体。Westernblot检测显示转染后Satb2蛋白表达显著上调。结论:针对大鼠Satb2基因过表达慢病毒载体构建成功,并能有效增强BMSCs中Satb2基因的表达。