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259 个结果
  • 简介:高质量mRNA分离和纯化是转录组文库构建和基因表达调控等生物学实验前提。为了调取较完整、纯度较高mRNA,本研究采用磁性分离技术调取mRNA,磁性复合微粒通过其表面的功能团与oligo(dT)_(25)相偶联,形成杂交体-磁珠复合体,外加磁场来实现mRNA快速分离,并经过不同试剂纯化后得到高质量mRNA,用于构建转录组文库。结果表明:mRNA被调取后,使用不同缓冲液纯化时对mRNA质量影响较大,经多次试验验证:结合缓冲液为2.5mol/LLiCl,洗脱缓冲液采用0.1mol/LLiCl和1%LiDS相结合进行纯化时,检测结果显示文库条带位于400~600bp之间,条带大小符合上机要求。高质量转录组文库构建为高通量测序和基因克隆等实验提供帮助。

  • 标签: MRNA 分离与纯化 转录组文库 磁性复合微粒
  • 简介:由植物病毒侵染而引起作物减产是农业生产中一个持久性问题,为了最大限度地减少病毒造成损害,确保农业可持续发展,探寻快速而精准检测方法对控制这些植物病毒至关重要。随着贸易全球化发展,加剧了病毒及其宿主和载体转移,这使得植物病毒检测技术变得更加重要。近年来,植物病毒检测技术发展很快,多种多样。本研究主要综述了一些植物病毒检测方法原理和特点,以及在植物病毒检测和诊断中应用,包括生物学方法、血清学方法、电镜观察方法以及分子生物学方法核酸分子杂交技术、双链RNA电泳技术、聚合酶链式反应技术(PCR,RT-PCR,实时荧光定量PCR,多重PCR,巢式PCR)、核酸序列扩增技术、环介导等温扩增技术等。

  • 标签: 植物病毒 检测技术 核酸 方法
  • 简介:淀粉含量是烤烟烟叶醇化品质高低一项重要指标,但目前淀粉含量测定方法较多且缺乏系统比较,造成不同测定方法获得结果横向比较性较差。本研究系统地比较了连续流动法、碘显色法、费林试剂滴定法、离子色谱法以及高效液相色谱法5种常见淀粉含量测定方法在红花大金元和K326烟叶淀粉含量测定中应用。使用5种方法测定了两个醇化初期烟叶样品中淀粉含量,采用标准偏差、回收率以及t检验法,比较了烟草行业标准方法连续流动分析法与其他测定方法结果之间差异性。结果表明,与行业标准连续流动法相比,费林试剂滴定法以及酶水解—离子色谱法,测定结果偏高,且准确度偏低;酸水解-高效液相色谱法测定结果偏低,虽具有很高精密度,但准确性不高;而碘显色法测定结果不但表现出较高准确性和精密度,且与连续流动法测定结果之间不存在显著性差异(t

  • 标签: 烟叶 淀粉 连续流动法 碘显色法
  • 简介:作为一个模式植物,烟草在植物分子生物学研究中发挥着重要作用。总RNA提取质量,对于基因表达、基因克隆、cDNA文库建立、RNA原位杂交以及转基因材料鉴定等分子生物学基础研究至关重要。尤其在进行基因克隆及cDNA文库时,只有高质量RNA,才能保证cDNA第一链合成完整性。由于烟草中糖类、蛋白质及次生代谢物含量较高,因此,在应用TRIzolRNA提取试剂盒进行烟草总RNA提取时,所提取RNA产物中蛋白质及多糖等杂质含量偏高。因此,针对这一问题,我们对TRIzol法进行了改进,并获得了高质量烟草总RNA。经琼脂糖电泳检测,利用该方法提取烟草总RNA,条带清晰、无拖尾现象,28S与18S比例约为2:1。紫外吸收值测定表明,所提取烟草总RNAA260/A280值基本达到了1.9以上,说明所提取RNA质量较高,可广泛应用于基因克隆及基因表达研究。

  • 标签: 烟草 RNA 提取方法
  • 简介:以卷丹、麝香百合品种富田和离体鲜切花花蕾为材料,比较Trizol法、异硫氰酸胍法、CTAB改进法和SDS改进法提取总RNA效果,结果表明,SDS改进法能有效去除多糖,提取RNA中28SrRNA亮度约为18SrRNA两倍,OD260/OD280值介于1.7-2.2之间,卷丹RNA得率为132.52μg/g,富田RNA得率为186.88μg/g。进一步用SDS改进法分别提取富田外轮花瓣、内轮花瓣、雄蕊、雌蕊、叶和茎RNA,同样可以获得完整纯度高RNA,其中28SrRNA亮度约为18SrRNA两倍,OD260/0D280值介于1.7~2.2之间,说明此方法适用于百合各个组织RNA提取。经RT—PCR获得了花发育基因特异性条带,说明用SDS改进法从百合中提取RNA质量好、产率高、完整性强,完全适合于百合进一步分子生物学研究。

  • 标签: 百合 RNA SDS改进法 多糖
  • 简介:本文对大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)发生危害概况、侵染特性、菌株分离方法、流行学调查、小种分化与鉴定方法、毒力基因多态性、基因多态性分子鉴定、SSR标记在基因多态性研究中应用等进行了系统综述,讨论了研究P.sojae生理小种遗传多样性方法,指出应用SSR分子标记进行P.sojae种下分类,确定生理小种间亲缘关系是可行.

  • 标签: 大豆 疫霉病 遗传多样性 研究方法 SSR分子标记 亲缘关系
  • 简介:为建立简单高效黄瓜转基因技术体系,本研究以携带有抗除草剂Bar基因农杆菌工程菌浸泡处理开花期黄瓜嫩梢,进行活体植株转基因方法研究。研究结果表明最佳转化体系为:表面活性剂silwet-77适宜浓度0.01%-0.05%;菌液浸泡最佳位置为顶部以下10cm嫩梢,最适子房发育时期为开花前5-12d子房;农杆菌菌株EHA105浸染效果优于LBA4404;3次重复浸泡处理有利于提高转化频率。黄瓜苗期除草剂抗性筛选适宜浓度为17%草胺膦1100倍稀释液。研究获得除草剂抗性植株1320株,PCR阳性植株36株,其中30株经Southern斑点杂交后有阳性信号,最高转化效率为9.5%。

  • 标签: 黄瓜 转基因 活体植株 抗除草剂
  • 简介:模板DNA质量直接影响PCR扩增结果,而不同提取方法及其缓冲液成份与浓度对提取DNA质量有重要影响.本文以5个栽培大豆品种叶片为材料,比较分析了SDS与CTAB两种提取方法以及不同浓度CTAB提取缓冲液对所提取DNA质量影响,并通过PCR进行检验.实验结果表明:用1%(W/V)、2%(W/V)浓度CTAB提取缓冲液和1.25%(W/V)SDS提取缓冲液所提取大豆叶片DNA质量较好,均能满足PCR扩增模板需求,其中以1.25%(W/V)SDS提取得到大豆叶片DNA质量最好,以其为模板扩增效果最佳,而4%浓度CTAB不适宜提取大豆叶片DNA.

  • 标签: PCR 大豆 叶片 DNA 提取方法 缓冲液
  • 简介:植物叶片中含有的多糖、蛋白质和多酚等物质,很大程度会影响总DNA提取质量。本研究以剑叶虾脊兰(Calanthedavidii)和银带虾脊兰(Calantheargenteo-striata)幼嫩叶片为材料,采用改良CTAB法提取总DNA,设置样品重量(0.05g,0.10g,0.20g)、清洗时间(10min,20min,30min)、水浴温度(25℃,60℃,45℃)、水浴时间(2h,1h,0.5h)4因素3水平正交试验,探究不同因素、不同处理对DNA得率和纯度影响,以获取最佳提取条件。研究发现剑叶虾脊兰和银带虾脊兰DNA最佳提取条件均为:样品重量0.2g、清洗时间30min、水浴温度60℃、水浴时间2h。该处理下剑叶虾脊兰DNA产率最高为490.5ng/μL,A260/A280均值为1.953;该处理下银带虾脊兰DNA产率最高为139.83ng/μL,A260/A280均值为1.967。各因素对剑叶虾脊兰DNA产率影响次序为:样品重量>清洗时间>水浴温度>水浴时间;各因素对银带虾脊兰DNA产率影响为:样品重量>水浴温度>清洗时间>水浴时间。本研究为虾脊兰属分子生物学研究提供科学依据。

  • 标签: 虾脊兰属植物 正交试验 DNA提取方法优化 分子生物学
  • 简介:本文介绍了一种用于PCR植物基因组DNA快速制备方法。该方法只需将少量(4~6mg)植物叶片、适量(200μL)TE缓冲液、和一粒钨合金珠放入1个2mL离心管,在多功能组织细胞研磨器中振动5min破碎组织后,直接取1μLDNA溶液作为PCR模板。本方法具有简单快速、操作效率高、成本低、扩增效果好等优点,特别适合于大量样品基因型检测。

  • 标签: 水稻 DNA制备 PCR
  • 简介:本研究利用4种父本育性较强二倍体香蕉(Musaspp.)种质,比较不同染色法和离体萌发法检测香蕉花粉活力效果,以期筛选适合香蕉花粉活力快速检测方法。结果显示:醋酸洋红和I-KI染色法处理后香蕉花粉形态较模糊,而TTC法与MTT法染色效果较好,花粉形态较清晰,容易区分染色与未染色花粉;适合香蕉花粉离体萌发培养基中,蔗糖浓度为15%,pH值为5.8;MTT染色法结果与离体萌发法结果相关性最好,说明MTT染色法结果较其他染色法准确、可靠。利用MTT染色法,本研究比较了17份二倍体香蕉种质花粉活力,结果显示:‘Calcutta4’(M.acuminatassp.burmannicoides(AA))、BGY3(M.balbisiana(BB))、Malaccensis(M.acuminatassp.malaccensis(AA))、Balbisiana(M.balbisiana(BB))等4份野生类型种质,以及双单倍体种质‘CIRAD930’(M.acuminatassp.malaccensisvar.DHPahang(AA))染色率超过50%,而3份改良二倍体种质和4份栽培类型种质染色率低于30%。

  • 标签: 二倍体香蕉 花粉生活力 测定方法 MTT染色法
  • 简介:为探索适于小麦籽粒蛋白质组学研究样品制备最优方法,本研究以Rht10鲁麦15开花后第31天籽粒为材料,采用4种不同蛋白质提取方法:TCA/丙酮法、尿素/硫脲法、酚提取法Ⅰ和酚提取法Ⅱ,对不同提取方法得到蛋白量以及蛋白分离结果进行比较分析。结果显示:TCA/丙酮法和尿素/硫脲法获得蛋白点较少,分别为484个和489个,蛋白质损失较大,蛋白质在碱性端(pH7附近)堆积严重;酚提取方法Ⅰ得到蛋白点709个,部分蛋白点弥散,碱性端蛋白轻微堆积;酚提取方法Ⅱ得到蛋白点866个,蛋白点清晰,无碱性蛋白堆积。研究结果表明,在小麦籽粒蛋白质组研究中,酚提取方法更为适合小麦籽粒蛋白提取,同时方法Ⅱ优于方法Ⅰ。

  • 标签: 小麦 籽粒蛋白 蛋白提取 双向电泳
  • 简介:TA克隆构建含MOC1基因cDNA片段重组质粒,作为TaqMan定量检测水稻分蘖基因MOC1mRNA标准品,建立了检测方法。采用RT—PCR。方法,从水稻分蘖芽总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增MOC1基因中设计目的片段,将纯化目的片段与pMD19-TSimple载体连接,转化宿主菌JM-109,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。对重组质粒进行实时荧光定量PCR实验。建立了MOC1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达10^2拷贝,线性范围为10^2-10^7拷贝,阈值循环数与PCR体系中起始模板量对数值之间有着良好线性关系(r=0.999),扩增效率高(E=92.8%)。成功建立了MOCI基因实时荧光PCR定量标准品,且TaqMan荧光定量RT—PCR方法可对水稻分蘖基因MOC1mRNA表达进行准确定量。

  • 标签: 水稻 分蘖 基因表达 实时定量RT—PCR TAQMAN探针
  • 简介:本研究以甜菜不育系(N9849)及保持系(960766)为材料,采用Label-free、质谱分析、生物信息学分析方法,对甜菜现蕾期花蕾进行比较蛋白质组学分析。结果表明:不育系与保持系中鉴定到96个差异蛋白,涉及16个功能组;其中胁迫响应,碳水化合物代谢,花粉发育等功能类别所占比例较大。胁迫响应功能蛋白类谷胱甘肽-S-转移酶、过氧化氢酶等在不育系中显著低表达,有毒物质及活性氧清除能力弱,可能导致不育系材料系统发生紊乱导致形成败育。碳水化合物代谢功能蛋白苹果酸脱氢酶,蔗糖合酶等在不育系中表达量较低,碳水化合物代谢强度低,能量代谢匮乏也是致使花粉不育一个原因。花粉发育相关蛋白Ⅲ型聚酮合酶在保持系中显著高表达,很好地维持了保持系育性。本研究在蛋白质组学水平为阐述甜菜明雄性不育机理及其利用提供理论依据。

  • 标签: 甜菜 核质互作雄性不育 LABEL-FREE
  • 简介:植物原生质体是进行细胞工程遗传操作和植物育种良好材料。由于部分植物不亲和障碍和特殊细胞信号传导途径研究等方面的需要,使得植物原生质体操作相关研究变得独居优势。我们对近年来植物原生质体分离方法及应用等方面的研究进展进行了综述。并对植物原生质体研究未来发展趋势进行了展望。指出在植物遗传操作及育种等方面,植物原生质体研究将变得不可或缺。研究影响植物原生质体再生因素可能是未来植物原生质体研究重要方向。

  • 标签: 原生质体 分离 应用 进展
  • 简介:本试验采用甜叶菊组培苗叶片为材料,以RAPD分子标记检验水浴温度与时间、取样重量以及优化步骤等三个DNA提取影响因素,进而以SRAP和MSAP分子标记技术对RAPD结果进行验证,以提高甜叶菊组培苗DNA提取效率。结果表明,水浴温度、时间为70℃30min(A2),取样量为0.1g(B2)时,提取到常规步骤9上清液V(C4)即可满足常规分子标记要求,且提取时间可减少1~1.5h。

  • 标签: 甜叶菊 DNA提取 分子标记
  • 简介:针对多浆旱生植物霸王富含多酚和多糖类物质特点,在常规异硫氰酸胍方法基础上进行改进,摸索出一种霸王叶和根总RNA提取方法。本方法主要通过在提取缓冲液中加入4%β-巯基乙醇以去除多酚物质干扰;用2mol/L醋酸钠(pH4.0)、水饱和酚和氯仿:异戊醇(24:1)抽提以去除多糖和蛋白物质。采用该方法提取霸王总RNA纯度高、完整性好,电泳条带清晰,OD260/OD280值在1.8~2.0之间,其质量完全可以满足进一步分子生物学研究要求。

  • 标签: 霸王 多酚 多糖 改进的异硫氰酸胍法 RNA提取
  • 简介:为探讨庙台槭不同组织DNA高效提取方法,分别以叶片和果实为材料,以完全随机区组试验设计,设置不同浓度β-巯基乙醇和不同浓度PVP作为预处理,采用试剂盒法提取基因组DNA,提取后对基因组DNA进行浓度、分光光度值测定以及PCR扩增,综合各项指标选择出效果最好预处理方法,并进一步以CTAB法进行验证,之后应用于不同个体庙台槭DNA提取中。结果发现:以庙台槭果实为材料,不需要预处理,提取DNA即可满足下游实验需要;以叶片为材料,用0.5%β-巯基乙醇和1%PVP预处理能有效提高提取DNA浓度和质量,经验证发现该预处理方法适用于CTAB法,且能够极显著地提高DNA提取浓度和质量;进一步应用于所有132个庙台槭个体总DNA提取,获得DNA均能满足后续实验要求。本研究为进一步研究庙台槭遗传多样性等工作提供帮助,同时也能够为槭属其他植物相关研究提供参考。

  • 标签: 庙台槭 多酚 组织 DNA提取
  • 简介:启动子是调控外源基因在植物体内表达“开关”。随着植物转基因技术广泛应用,无论是基础研究还是应用研究,人们希望能够充分利用启动子来准确控制外源基因在植物体内表达,使目的基因“开”和“关”、表达“多”和“少”、在“何地”和“何时”表达等。能够听从人指挥,以实现植物育种分子设计。因此,快速分离和鉴定植物体内各种特异启动子已经成为植物基因工程研究热点和难点。本文在互补末端连接反向PCR(CELI—PCR)技术基础上建立起…种快速分离目的基因全长cDNA和启动子序列方法。该方法利用CELI—PCR进行染色体连续步移,获取足够长目的基因及其上游基因组DNA序列,再根据转录起始位点是目的基因转录本和启动子分界点,其下游转录本中外显于可通过RT-PCR扩增,而上游启动子序列则不能被RT-PCR扩增这一特点,借助RT-PCR进行cDNA连续步移,直到获得全长cDNA,确定启动子基因5’非翻译区位置,进而精确定位转录起始位点。从而获取目的基因准确启动子序列和全长cDNA序列。因此,建立在CELI,PCR基础上RITIS技术,可绕过繁琐构建cDNA库和5'-RACE等方法快速分离目的基因全长cDNA和启动子序列。

  • 标签: 启动子 全长CDNA 转录起始位点
  • 简介:简要介绍了5种传统、最常用DNA分子标记(RFLP、RAPD、AFLP、SSR和SNP)技术原理及它们优缺点,也总结了TRAP这种新产生分子标记技术原理、优点及应用前景。综述了这几类分子标记在花生种质进化、遗传多样性分析、分子图谱构建及抗虫、抗病等方面的研究。利用SSR和RAPD标记能够发现野生种和栽培种多态性进而实现分子标记对花生遗传多样性分析,可以将许多花生品种分为不同品种群,能够对花生进行种质进化研究。RFLP和AFLP技术利于花生图谱构建,利用DNA中特定限制性酶切位点上碱基对改变及酶切位点之间分予重排,可以发现花生品种间DNA许多多态性位点,进而绘制分子标记图谱。AFLP技术在花生青枯菌和花生抗黄曲霉研究方面有很大进展。RAPD技术在花生根瘤菌、花生线虫病等方面已有显著进展。最后对分子标记在花生育种中应用前景进行了简单展望。

  • 标签: 花生 分子标记 辅助育种