简介:摘要目的优化建立适合本实验室针对人源福尔马林固定石蜡包埋(Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded, FFPE)样本的全基因组(Genomic DNA, gDNA)文库构建方案。方法探讨并设计了在FFPE全基因组文库构建各环节优化条件,分析比较FFPE DNA文库片段大小及文库转化率,以选择最优的文库构建流程。结果最终确定DNA起始量50 ng、20 min片段化酶切时间,采用4×稀释的接头进行20 min连接,经过2次特定比例的磁珠筛选方案进行文库构建,实现片段主峰在300 bp~400 bp左右,文库转化率达60%。结论本操作流程针对FFPE样本可以保证高质量的文库构建,同时实现较高文库转化效率。
简介:摘要目的探讨乳腺癌甲醛固定石蜡包埋(formalin-fixed and paraffin-embedded,FFPE)穿刺样本杂交捕获法二代测序(next-generation sequencing)样本优选条件。方法纳入多中心乳腺癌FFPE穿刺样本共计435例,选取燃石36基因检测试剂盒二代测序数据分析。纳入样本保存时间、切片厚度、降解等级、建库后的浓度、核酸片段大小、下机数据质量等质控信息。结果435例样本中111例核酸总量低于30 ng,剩余28例DNA质量低于C级,最终296例进入质控分析。保存时间分布为:<1年188例;1~2年74例;>2~3年34例,其DNA降解程度分布为:A级(>2 500 bp)67例(22.6%);B级(1 500~2 500 bp)155例(52.4%);C级(<1 500 bp)74例(25.0%)。预文库质控合格样本(300 ng)的分布为:A级65例(97.0%);B级138例(89.0%);C级64例(86.0%)。终文库片段大小280 bp以上合格样本分别为:A级66例(98.5%);B级151例(97.4%);C级72例(97.3%)。保存<1年、1~2年、>2~3年样本根据下机数据插入片段质控合格(>170 bp),所占比率分别为:156例(83.0%)、45例(60.8%)和25例(73.5%)。降解程度分布分别为:A级 54例(80.6%);B级 127例(81.9%);C级 46例(62.2%)。结论FFPE穿刺样本杂交捕获法二代测序样本优选条件:(1)切片总厚度不低于50 μm;(2)保存时间优选<1年样本;(3)核酸降解优选A级。