简介:目的:探讨RNA干扰技术沉默survivin基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:设计并合成靶向survivin的小分子干扰RNA(siRNA),在脂质体(lipidosome)的介导下转染人乳腺癌细胞株MCF-7,荧光倒置显微镜观察细胞的转染效率;MTT(四甲基偶氮唑盐)比色法分析检测各组癌细胞的存活率;流式细胞计数检测各组癌细胞周期和凋亡指数;WesternBlot方法观察对MCF-7细胞survivinmRNA和蛋白质表达的抑制效率。结果:Survivin-siRNA能有效封闭survivin基因的表达,使survivin的mRNA相对水平明显降低(P〈0.05);Survivin-siRNA能明显抑制细胞增殖(P〈0.05);Survivin-siRNA使细胞G2/M期细胞百分比明显增加,S期的细胞百分比显著减少(P〈0.05)。结论:利用RNA干扰技术沉默survivin基因的表达可以显著抑制MCF-7细胞的增殖,并在一定程度上诱导其自发凋亡,靶向survivin的RNA干扰技术在乳腺癌的基因治疗中具有一定的研究价值。
简介:摘要目的探究人表皮生长因子样结构域蛋白7(epidermal growth factor-like domain protein 7,EGFL7)基因在人宫颈癌细胞Hela中低表达对其迁移与侵袭能力的影响。方法将人宫颈癌细胞Hela分为实验组(Hela细胞转染EGFL7-siRNA)和对照组(Hela细胞转染Mock-siRNA),采用实时定量PCR法检测两组细胞中EGFL7 mRNA的含量;蛋白免疫印迹实验检测两组细胞EGFL7蛋白的表达量;利用细胞划痕愈合实验和transwell实验检测两组Hela细胞的迁移与侵袭能力。结果siRNA降低了人宫颈癌细胞Hela中EGFL7的蛋白表达;对照组Hela细胞划痕愈百分率为74.1%±6.8%,EGFL7表达降低后宫颈癌细胞划痕愈合百分率为42.0%±4.9%,划痕愈合能力明显下降(P<0.05);Transwell细胞转移结果显示,对照组Hela细胞成功转移的细胞数量为179.24±20.01,而低表达EGFL7的Hela细胞成功转移的细胞数量为79.22±13.16,转染EGFL7-siRNA的细胞转移能力显著下降(P<0.05);侵袭实验结果表明,对照组成功转移的细胞数量为79.35±8.04,EGFL7-siRNA组成功转移的细胞数量为26.98±6.24,低表达EGFL7的Hela细胞侵袭能力明显下降(P<0.05);低表达EGFL7的Hela细胞E-cad表达上调,MMP2/9蛋白的表达下调(均P<0.05)。结论EGFL7低表达会通过上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)EMT降低人宫颈癌细胞Hela的迁移与侵袭能力。
简介:目的鉴于骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP)异源二聚体较BMP同源二聚体有更高效的诱导成骨作用,比较研究纯化的重组人BMP2/7(rhBMP2/7)异源二聚体与rhBMP2和/或rhBMP7同源二聚体在诱导细胞成骨分化上相关基因的表达变化.方法以不同浓度的3种rhBMPs作用于成骨前体细胞MC3T3-E1,检测细胞碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性变化,比较研究成骨分化相关基因ALP、骨钙素(osteocalcin,OCN)、Ⅰ型胶原蛋白(collagentypeⅠα1,Coll)以及核心结合因子(runt-relatedtranscriptionfactor2,Runx2/corebindingfactorαl,Cbfαl)的表达变化.结果RhBMP2/7异源二聚体上调细胞ALP活性的浓度效应呈钟形曲线;其诱导细胞成骨相关基因的表达也呈类似的钟形曲线;而相应的同源二聚体则呈现浓度依赖效应递增曲线.此外,rhBMP2/7异源二聚体与rhBMPs同源二聚体相比,诱导的Runx2的基因表达变化不同于ALP、OCN或Coll基因表达,提示后3种基因的表达并不完全依赖于Runx2基因的表达转录.结论RhBMP2/7异源二聚体在诱导细胞成骨分化基因表达上仅在早期以及较低浓度范围内与相应rhBMPs同源二聚体有显著性差异;基因表达转录后,成骨相关蛋白的合成、修饰及活化程度不同更可能是造成rhBMP2/7异源二聚体与相应同源二聚体生物学活性差异的主要原因.
简介:目的构建Wilson病基因ATP7B的重组腺病毒载体.方法分别以BamHⅠ+SalⅠ双酶切pcDNA3.0/ATP7B和pDC315,将ATP7BcDNA目的基因片段和线性化的pDC315连接,定向克隆构建pDC315/ATP7B,以PCR和酶切的方法鉴定.pDC315/ATP7B与腺病毒骨架共转染293细胞构建Ad-ATP7B,PCR进行鉴定.结果经PCR和酶切鉴定证实pDC315/ATP7B构建成功.pDC315/ATP7B与腺病毒骨架共转染293细胞后见明显的毒斑,说明二者在293细胞中同源重组并包装成功.经PCR证实重组腺病毒Ad-ATP7B构建已完成.结论本实验成功构建了ATP7B外源目的基因序列完全正确的重组腺病毒载体Ad-ATP7B,为下一步采用ATP7B基因重组腺病毒载体对Wilson病进行基因治疗打下了基础.