简介:摘要: 目的: Hippo 信号通路异常会导致胃癌发生和进展。Hippo 信号通路的核心成分主要受泛素-蛋白酶体调控,然而其在胃癌中的作用还不清楚。本研究旨在探讨 FBXW5 与 Hippo 信号通路的关系及其在胃癌中的临床意义。 方法: 蛋白免疫印迹法分析裸鼠瘤体中 FBXW5 的表达,及细胞中 FBXW5 蛋白与 Hippo 通路相关蛋白的调控关系;Transwell小室试验、细胞划痕试验用于探讨FBXW5 对胃癌细胞侵袭或迁移能力的影响;裸鼠皮下成瘤实验验证 FBXW5 对移植瘤生长速率的影响。结果: Western blot 实验证明 FBXW5 蛋白在胃癌中高表达,FBXW5 对 Hippo 信号通路存在调控作用,FBXW5 沉默将减缓皮下移植瘤的生长速率。结论: FBXW5 通过结合并促进 LATS1 的泛素化和降解失活 Hippo 信号通路,促进胃癌细胞的侵袭、转移。
简介:目的:克隆并表达caspase-8/10相关RING结构域蛋白1(CARP1)基因,检测其泛素连接酶活性。方法:提取结肠癌HCT116细胞总RNA,RT-PCR扩增CARP1基因,将其克隆到真核表达载体pcDNA3-Flag中,序列正确的阳性克隆进行扩增,提取质粒转染至293T细胞中进行瞬时表达,通过体内泛素化检测其泛素化酶活性,通过萤光素酶报告基因的方法检测其对NF-kB转录活性的影响,利用细胞生长曲线检测CARP1基因对结肠癌细胞生长的影响。结果:免疫印迹实验表明CARP1基因在293T细胞中获得有效表达;免疫共沉淀实验表明,当CARP1存在时,受体相互作用蛋白1(RIP1)被泛素化;萤光素酶实验结果表明CARP1抑制肿瘤坏死因子a(TNFa)引起的NF-kB报道基因的激活;通过生长曲线发现CARP1能促进结肠癌细胞系HCT116生长,并能部分抵抗顺铂抑制细胞生长的作用。结论:构建的人CARP1基因真核表达载体在293T细胞中获得表达,表达产物具有RIP1泛素连接酶的活性,可抑制TNFa引起的NF-kB报告基因的激活,并且促进结肠癌细胞的生长,为进一步的基因功能研究奠定了基础。
简介:目的探讨泛素连接酶Hrd1与L型氨基酸转运载体1(LAT1)在胃癌组织中的表达及临床意义。方法采用免疫组化、反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)及Westernblotting检测62例胃癌及癌旁组织中Hrd1和LAT1的表达水平,并分析2种蛋白表达的相关性及与胃癌临床病理特征的关系。结果Hrd1、LAT1蛋白在胃癌组织中的阳性表达率分别为54.8%(34/62)和56.4%(35/62),明显高于癌旁正常组织的25.0%(5/20)和20.0%(4/20),差异均有统计学意义(P〈0.05)。Hrd1在胃癌组织中的表达仅与肿瘤大小有关(P〈0.05),LAT1表达与肿瘤大小、临床分期有关(P〈0.05)。RT-PCR检测显示,胃癌组织中Hrd1与LAT1的相对表达量分别为4.22±0.83和5.80±1.72,高于癌旁组织的1.14±0.39和1.32±0.77(P〈0.05)。Westernblotting检测显示,胃癌组织中Hrd1和LAT1的相对表达量分别为0.855±0.153和0.896±0.148,高于癌旁组织的0.357±0.178和0.439±0.136(P〈0.05)。Hrd1与LAT1蛋白的表达水平呈正相关(r=0.820,P〈0.001)。结论Hrd1与LAT1在胃癌组织中的表达均高于癌旁正常组织,提示两者可能在胃癌的发生、发展中发挥重要的作用。
简介:摘要目的探讨泛素连接酶FBW7是否在肝癌细胞HepG2中参与泛素化修饰锌指转录因子Snail而影响侵袭和转移。方法通过转染沉默HepG2细胞(购自武汉普诺赛生命技术公司)FBW7的表达48 h后,实验组为沉默FBW7的HepG2细胞,对照组为空白载体转染,分别检测FBW7、Snail mRNA及蛋白表达。通过划痕实验和Transwell方法检测下调FBW7对HepG2细胞侵袭和转移的影响。组间比较采用t检验。结果转染沉默HepG2细胞FBW7基因表达后,FBW7 mRNA(0.31±0.06比0.98±0.25,t=-7.813,P<0.05)及蛋白(0.29±0.03比1.00±0.00,t=-63.967,P<0.05)表达均下调,差异有统计学意义;锌指转录因子Snail mRNA(1.59±0.06比0.99±0.07,t=18.630,P<0.05)及蛋白(1.75±0.20比1.00±0.00,t=11.323,P<0.05)表达均上调,差异有统计学意义;划痕实验显示HepG2细胞迁移能力增加(256.00±35.21比185.00±22.45,t=4.855,P<0.05),Transwell实验显示HepG2细胞穿透数目增多[(271.00±55.32)个比(162.00±33.14)个,t=4.138,P<0.05],差异均有统计学意义。结论FBW7可能通过泛素化修饰Snail而抑制肝癌细胞HepG2的侵袭转移。
简介:摘要目的筛选含有WW结构域的泛素蛋白连接酶1(WWP1)相互作用蛋白,探讨WWP1和依托泊苷诱导蛋白24(EI24)对肝癌细胞增殖的影响。方法利用酵母双杂交的方法筛选与WWP1相互作用的蛋白,并利用免疫共沉淀来进行相互作用验证。通过体内泛素化实验验证泛素连接酶WWP1与EI24酶和底物的关系。以慢病毒感染的方法建立WWP1和EI24稳定过表达或敲低表达的肝癌细胞系。通过细胞增殖实验、平板克隆实验和裸鼠成瘤实验检测WWP1和EI24对肝癌细胞增殖的影响。结果WWP1可以与底物EI24相互作用,并能够在体内将EI24泛素化降解。成功构建稳定过表达或敲低表达的WWP1和EI24的肝癌细胞系HepG2。在HepG2细胞中,过表达WWP1可以降低内源EI24的蛋白水平,而敲低WWP1可以使EI24蛋白水平增加。细胞计数盒8(CCK-8)法检测结果表明,在36 h时,WWP1过表达组和shWWP1组细胞的相对增殖活性分别为(347.00±8.15)%和(187.08±4.86)%,与对照组(270.33±15.01)%比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。在36 h时,EI24过表达组和shEI24组细胞的增殖活性分别为(183.75±8.11)%和(317.33±9.60)%,与对照组(270.33±15.01)%比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。克隆形成实验结果显示,对照组、WWP1过表达组和shWWP1组的克隆形成数分别为(52±7)个/视野、(76±4)个/视野和(19±3)个/视野,WWP1过表达组细胞克隆形成明显增多(P<0.05),而敲低WWP1后细胞克隆形成较对照组减少(P<0.05)。对照组、EI24过表达组和shEI24组的克隆形成数分别为(38±4)个/视野、(10±3)个/视野和(69±7)个/视野。与对照组比较,过表达EI24使细胞克隆形成明显减少(P<0.05),敲低EI24的表达使细胞克隆形成明显增多(P<0.05)。裸鼠体内实验结果显示,经过4周同等条件喂养后,对照组、WWP1过表达组和shWWP1组的裸鼠移植肿瘤体积分别为(1 400.00±43.71)mm3、(2 636.67±290.45)mm3和(642.17±36.00)mm3,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组、WWP1过表达组和shWWP1组的裸鼠移植肿瘤重量分别为(1.23±0.08)g、(2.05±0.17)g和(0.88±0.09)g,差异均有统计学意义(P<0.05)。WWP1过表达组细胞成瘤能力明显增强,shWWP1组成瘤能力明显减弱。对照组、EI24过表达组和shEI24组的裸鼠移植肿瘤体积分别为(1 245.17±93.10)mm3、(662.17±60.88)mm3和(1 986.67±226.75)mm3,差异有统计学意义(P<0.05)。对照组、EI24过表达组和shEI24组的裸鼠移植肿瘤重量分别为(1.15±0.04) g、(0.85±0.02)g和(1.73±0.05)g,差异有统计学意义(P<0.05)。EI24过表达组细胞成瘤能力明显减弱,shEI24组成瘤能力明显增强。结论WWP1可以靶向底物EI24进行泛素化降解,并促进肝癌细胞的增殖。
简介:利用构建的犬2型腺病毒E3区缺失质粒pBE3L分别构建了含有和不含外源性启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因和狂犬病病毒糖蛋白(Rgp)基因的重组表达质粒pBE3LGFP、pBE3LCGFP、pBE3LRgp和pBE3LCRgp,并分别对DK细胞进行了转染实验,以检测其表达,结果显示,pBE3LCGFP质粒在转染DK细胞后,于36h即可观察到荧光,72~96h无明显差别,传3代后仍可见表达荧光的细胞,pBE3LCRgp质粒转染DK细胞后,于48~96h用间接免疫荧光染色可检测到糖蛋白的表达,而pBE3LGFP和pBE3Rgp质粒转染DK细胞后经检测均无表达,表明构建的E3区缺失性载体不能利用E3区自身的启动子进行目的基因的表达,但利用外源性启动子可使外源基因获得良好表达.
简介:A New E3 Transition from 9+ Isomer in 144Pm NucleusANewE3Transitionfrom9+Isomerin144PmNucleus¥ZhangYuhu;Y.Gono;ZhaoQinz...
简介:也许广大学生朋友会问:什么是E3大展?主要内容是什么?下面做个简单的介绍!