吸附层析分离叶子色素的实验改进研究

引言
吸附层析法是利用吸附剂表面对溶液中的不同物质所具有的不同程度的吸附作用进行分离的。固体物质表面具有分子的特性，如氧化铝、碳酸钙、硅胶、蔗糖和活性碳等等，特别是多孔和细粉末时，其表面积很大，它们可以把溶液中的分子吸附到固体的表面来使表面过剩自由能降低[1]，达到稳定状态。不同的物质与吸附剂间的亲和力不同，固体物质对它们的吸附力就不同，因此当有机溶剂从吸附剂表面流过的时候，吸附力强的随有机溶剂的移动就慢，吸附力弱的随有机溶剂的移动就快，于是不同的物质得以分离。
一、实验概况
根据吸附层析的原理，本实验是在层析柱中装入氧化铝、碳酸钙和蔗糖等吸附剂作为支撑，其中蔗糖为主要吸附剂，用有机溶剂进行洗脱，叶绿体中的色素不断的经历被吸附、溶解、再吸附、再洗脱的过程随有机溶剂的流动向下移动。由于混合物中各物质的结构，极性和溶解度均不同，被吸附的程度就不同，最后被分开。
叶绿体色素主要有两类[2]，即叶绿素类和类胡萝卜素，且含量在植物叶片中为叶绿素：类胡萝卜素＝3：1。叶绿素类又包括叶绿素a与叶绿素b，叶绿素a：叶绿素b＝3：1。其中叶绿素分子包括两个部分：头部由一个镁噗啉环组成，具有亲水性；尾部由长的碳氢链组成，形成一端亲水、一端亲脂的结构。叶绿素a在侧链基团，即1，3位上有一个甲基，叶绿素b的2，3位上侧链基团为醛基，因此叶绿素b的亲水性较叶绿素a强。

图1：叶绿素分子结构
类胡萝卜素：包括叶黄素和胡萝卜素。它们均为由40个碳和56个氢组成的不饱和碳氢化合物，在两头各有一个对称排列的紫罗兰酮环，其中叶黄素含有两个－OH，叶黄素的亲水性应该大于类胡罗卜素。

图2：叶黄素、胡萝卜素分子结构
从分子结构可知，上述四种色素，叶绿素b极性最强，其次为叶绿素a、叶黄素和胡萝卜素，因此它们随有机相移动的速度也不相同，按照从上到下叶绿素b、叶绿素a、叶黄素、胡萝卜素的顺序依次展开。
二、改进方案
在三种吸附剂中，氧化铝、碳酸钙和蔗糖的极性比较，蔗糖最强，比表面积比较为氧化铝最小，而蔗糖最大，因此就吸附剂对表面自由能的降低能力而言，蔗糖的分离效果最好，所以我们在保留蔗糖组分的前提下，将氧化铝和碳酸钙也作为主要吸附剂进行比较实验设计，装柱方案从单一的氧化铝2cm+碳酸钙3cm+蔗糖7cm进行了改革，将学生分为2人一组，在层析柱总长保证12cm的前提下，以氧化铝、碳酸钙和蔗糖分别作为主要吸附剂，按下列五个方案完成装柱，见表一：
表一：吸附层析的装柱方案

三、实验结果与讨论
按照方案1-3进行装柱，结果如图3：其中的蔗糖为主要吸附剂，距离也最长，由于3种吸附剂中蔗糖良好的极性和较大的比表面积，使叶子色素在蔗糖中的分离效果最好，基本上将4种主要色素按照顺序进行了分离，而在碳酸钙和氧化铝中几乎没有现象。绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)，其差别仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍；而胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。所以 在结果中可以看到从上至下依次是叶绿素b——叶绿素a——叶黄素——胡萝卜素，且从层析分离的带宽中也可以看出各自量的比较，叶绿素a＞叶绿素b，叶黄素＞胡萝卜素。颜色也非常清晰，叶绿素b为黄绿色，叶绿素a为蓝绿色，叶黄素为亮黄色，胡萝卜素为不太清晰的橙黄色，且胡萝卜素的吸附性最弱，在方案1中几乎流动到了氧化铝层，这与它的分子结构是吻合的。

图3：方案1-3实验结果
按照方案4-5进行装柱，结果如图4：叶子色素在碳酸钙中也得到分离，但分离效果不如蔗糖，2种叶绿素的分离效果较好，颜色和量的比例都较为清晰，但叶黄素没有色带，胡萝卜素色带清晰，且展开速度慢。这可能是因为碳酸钙有保护色素的能力[3]，如果碳酸钙过多则会影响色素的提取，图4B是氧化铝+碳酸钙的对照，结果是叶黄素和胡萝卜素得到一定程度的分离，颜色不很清晰，也没有浓度比较的显示，而2种叶绿素却在氧化铝中未得到分离，说明氧化铝的层析分离效果远不如前二者。通常氧化铝的吸附能力与其自身的含水量有关。含水越多，吸附活性越小，吸附能力越小[4]。

图4：方案4-5实验结果
四、结论
通过吸附层析分离叶子色素的实验改革，学生对实验的原理加深了印象，并对不同吸附剂进行了比较和分析，也对叶子色素的种类以及分子结构和理化性能的差异有了较深的印象，特别是对吸附层析分离混合物的影响因素有较为全面的学习和理解，使学生的在实验理论的定性、定量知识范围和比较分析问题的能力得到了很大提高。

重庆工商大学教学改革资助项目，NO.073006
[参考文献]
[1]陈金龙,沈春银,刘定伦,叶正欣,张全兴,何炳林.具有高比表面积的极性吸附树脂的合成和性能研究[J].高分子学报,1994,(02).
[2]蒋焕煜,应义斌.尖椒叶片叶绿素含量的近红外检测分析实验研究[J].光谱学与光谱分析,2007,(03).
[3]秦广超,杜仁忠,黄云华.国内超细重质碳酸钙生产的现状及其发展[J]. 中国粉体工业,2006,(04).
[4]吴晓雨,缪恒锋,阮文权.活性氧化铝、锰砂和煤的磷吸附能力比较研究,上海环境科学,2010,（06）
（作者单位：重庆工商大学环境与生物工程学院 重庆）