小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞的研究进展

【摘要】 小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell , ES cell）体外培养可以分化成为外胚层组织，并进一步分化为神经元和神经胶质细胞。这些细胞已用于中枢神经系统疾病的细胞替代治疗和治疗药物的研发。小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞的方法主要有拟胚体介导的神经细胞分化、基质细胞诱导的神经细胞分化、默认模式介导的神经细胞分化、单层粘附培养诱导的神经细胞分化和遗传工程介导的神经细胞分化等。本文综述了这些分化方法。

　　【关键词】 胚胎干细胞; 神经细胞; 分化

　　Progress in directed differentiation of mouse embryonic stem cells into neural cells

　　【Abstract】 Mouse embryonic stem cells can give rise to ectodermal derivatives in culture and can be further induced into neurons and glia for cell-replacement therapies in the central nervous system and for use in drug discovery. The methods of directed differentiation of mouse embryonic stem cells into neural cells include neural differentiation from embryonic stem cells via embryoid bodies, stromal cell induced neural differentiation, default model mediated neural differentiation, adherent monoculture induced neural differentiation, genetic engineering mediated neural differentiation and so on. Here we review these methodologies.

　　【Key words】 embryonic stem cell; neural cell; differentiation

小鼠胚胎干细胞于1981年首次由Evans和Kaufman［1］成功分离建系，它们来源于胚泡的内细胞团（inner cell mass , ICM），这些细胞具有稳定的二倍体核型，在体外可以分化为三个胚层的多种细胞。将小鼠胚胎干细胞重新植入胚泡可以参与形成胚胎。体外ES细胞维持未分化状态依赖于一些细胞因子的存在，如白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor , LIF）［2］。撤去这种自我更新的刺激信号后，ES细胞很快分化为多种细胞。这些属性使ES细胞成为非常有用的发育生物学和功能基因组学研究的生物系统［3］。

　　1 拟胚体（embryoid bodies, EBs）内神经细胞的分化

　　小鼠ES细胞通过拟胚体分化为神经细胞主要有以下两种方案。

　　1.1 “4-/4+方案”［4］ 将小鼠ES细胞无LIF培养4天，形成EB；再用维甲酸（retinoic acid, RA）处理4天，然后在明胶（gelatin）［5］或层粘连蛋白（laminin）［4］包被的组织培养皿上培养［6］。培养6天后，细胞出现明显的神经细胞形态，开始表达神经细胞特异的基因，如神经微丝轻链（neurofilament light chain）、微管相关蛋白2和5（MAP2、MAP5）等。这些细胞对一系列神经递质和去极化电流起反应，证实了它们是可以传递兴奋的神经元。这一方案还会分化出神经胶质细胞，多数为星形胶质细胞，但也有少突胶质细胞的存在［7］。RA是一类促神经生长因子，不仅对多潜能干细胞有诱导作用，对神经前体细胞也有促进增殖、成熟的作用。RA与受体RAR、RXR结合，后者活化后与RA反应元件（RARE）结合，激活神经细胞相关基因并抑制中胚层相关基因的转录［8］。Wiles 等人的实验表明RA通过激活抑胰蛋白（follistatin）抑制骨形态形成蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）而使小鼠ES细胞向神经细胞方向分化［9］。
　　
　　该方案时间短、成本低，是目前使用较为广泛的神经细胞诱导方法。其不足之处是EB的外层细胞先分化而内层细胞仍保持未分化状态, 分化不均一，得到的细胞种类复杂，不利于纯化。

　　1.2 “五步法”方案［10］ (1)扩增未分化的胚胎干细胞；(2)去除分化抑制剂或促有丝分裂素，ES细胞开始分化，不贴壁悬浮生长，形成EB；(3)去除生长因子，选择巢蛋白（nestin）阳性细胞（即神经前体细胞）；(4)使用神经细胞培养液，添加生长激素、神经营养因子，扩增神经前体细胞；(5)利用促神经元存活因子诱导并维持神经元成熟。该方案不用RA处理EB，而是将EB在一种选择性的无血清培养基上培养。因为EB中的非神经细胞不能在这种培养条件下生存，所以大部分存活下来的细胞是nestin阳性的神经前体细胞［11］。这些神经前体细胞可被高效地诱导分化为神经元［12］。

　　该方案的主要优点是在进一步分化为神经元或神经胶质细胞之前，神经前体细胞已经得到较高的纯化，这有利于特定类型神经细胞的获得。但是，其操作较“4-/4+方案”复杂，而且多种生长激素、神经营养因子的应用增加了成本且不利于分化机制的阐明。
　　
　　通过EB途径由ES细胞分化而来的神经元多数为γ-氨基丁酸（GABA）能神经元，少数是谷氨酰胺能神经元。通过改变诱导分化的条件，可以得到不同类型的神经元或神经胶质细胞，并提高分化效率。腹侧中脑和后脑是多巴胺能神经元和5-羟色胺能神经元产生的部位，SHH(sonic hedgehog)和FGF-8（fibroblast growth factor-8）对这两部分的形态发生起重要作用［13］，Lee等人［10］用这两种分子处理EB来源的神经前体细胞得到了多巴胺能神经元和5-羟色胺（5-HT）能神经元。 2002年Wichterle等人［14］用背侧分子（RA）和腹侧分子（Hh-Ag1.3,一种SHH的拮抗剂）处理EB，得到了腹侧脊髓运动神经元。2005年Tsuchiya等人［15］在经典的“五步法”方案基础上，在第五步除去bFGF（basic fibroblast growth factor），用含有层粘连蛋白的N2培养液中成功诱导分化出微小胶质细胞，并进一步用含有胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和粒单细胞集落刺激因子（GM-CSF）的RPMI-1640培养液扩增细胞，得到89.0%的微小胶质细胞。

　　2 基质细胞诱导的神经细胞的分化

　　第二类诱导神经细胞分化的方法是基质细胞诱导方法，该方法的诱导机制尚不清楚，目前称为“基质细胞来源的诱导活性作用（stromal cell-derived inducing activity , SDIA）”［16］。

　　2000年Kawasaki等人描述了一种经基质细胞诱导ES细胞分化为多巴胺能神经元的方法［16］。这一方法中，神经细胞的分化通过ES细胞与小鼠骨髓来源的基质细胞PA-6细胞单层共培养而实现。实验结果表明，92%的细胞表现为神经细胞黏附分子（nerve cell adhesion molecule, NCAM）阳性，其中多数为酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）阳性细胞。酪氨酸羟化酶是多巴胺生物合成的限速酶，因此是多巴胺能神经元的一个很好的分子标志。2005年Yamozoe等人［17］用含有肝素的磷酸盐缓冲液冲洗培养的PA-6细胞得到含有所谓神经诱导因子（neural inducing factors, NIF）的溶液，用此溶液培养小鼠ES细胞，发现小鼠ES细胞可以在含有33%NIF溶液的培养液中生存，并且随着培养液中肝素浓度的增加，ES细胞分化为神经细胞的比例也增高。值得注意的是，PA-6细胞介导的神经细胞分化受到血清或BMP-4的抑制，血清和BMP-4的加入可引起ES细胞分化为多种非神经细胞。PA-6细胞的SDIA作用并不能使所有类型的干细胞诱导分化为多巴胺能神经元，例如，2005年Roybon等人［18］报道，对于神经前体细胞，PA-6细胞不能促进其向多巴胺能神经元分化，而是促进其向星形胶质细胞的分化。

　　2003年Barberi等人［19］描述的一种经基质细胞诱导分化的方法可以将ES细胞分别诱导分化为多种神经细胞。这一方法将小鼠骨髓来源的基质细胞MS5或S17或主动脉-性腺-中肾区来源的原始基质细胞作为饲养层细胞与ES细胞在血清替代培养液中共同培养，得到神经前体细胞，再用不同的细胞因子序贯处理这些神经前体细胞，分别可以得到较高百分比的胆碱能神经元、5-羟色胺能神经元、多巴胺能神经元、γ-氨基丁酸能神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。将得到的多巴胺能神经元注射到6-OHDA诱导的帕金森模型动物的患侧纹状体内，8周后由中枢神经系统兴奋剂amphetamine或者纹状体D1、D2受体激动剂apomorphine所诱导的旋转不稳定症状得到了显著改善，并且可以在注射细胞的纹状体内发现大量的酪氨酸羟化酶阳性细胞。

　　基质细胞诱导神经细胞分化的方法可以高效获得某种特定的神经细胞，例如，多巴胺能神经元和胆碱能神经元。然而，作用机制还有待进一步阐明。

　　3 默认模式（default model）介导的神经细胞分化

　　2001年Tropepe等人［20］发现小鼠ES细胞在低密度、无血清、无饲养层细胞的条件下培养7天后，约0.2%的细胞可形成神经球（neurosphere），并进一步自发分化为神经细胞，这种分化方法称为默认模式。这是抑制神经分化的信号分子表达降低的结果。Wiles等人［9］发现在神经分化过程中，可以检测到BMP、TGFβ等基因的表达下调。BMPs在神经发育早期与细胞表面丝/苏氨酸受体结合激活Smad蛋白，后者进入核内抑制Mash1、Math1、Ngn1/2、NeuroD等转录因子的活性，调节下游基因的表达，从而抑制神经分化［21］。BMP4处理的小鼠ES细胞在分化过程中神经元数量大为减少［22］；而用 noggin、follistatin、chordin、Cerberus等BMPs的拮抗剂处理小鼠ES细胞则可促进ES细胞向神经细胞方向的分化。

　　该方法促进神经分化的效率较低，单独应用此法诱导神经细胞分化并不多见。

　　4 单层粘附培养诱导的神经细胞分化

　　2002年Pacherník等人［23］在不形成EB和不用RA处理的情况下，将小鼠ES细胞生长在含有胰岛素（insulin）、转铁蛋白（transferrin）、硒元素（selenium）和纤连蛋白的无血清DMEM/F12培养液中，发现分化的细胞多数表达MAP-2等神经细胞的标志性蛋白。2003年Ying等人［24］将细胞密度为0.5～1.5×104/cm2的小鼠ES细胞培养于0.1%明胶包被的组织培养皿上，以N2B27作为培养液，培养4天后，60%以上的细胞分化为神经前体细胞。该方法形成的神经前体细胞具有良好的可塑性：神经前体细胞在N2B27培养液中培养，得到的细胞多数为GABA能神经元；FGF8和SHH处理神经前体细胞可以得到较多的多巴胺能神经元。

　　此类方法将形成EB的三维培养模式简化为单层粘附培养的模式，降低了复杂程度，有利于神经细胞分化早期事件的分子机制研究，而培养液中各成分发挥的作用需要进一步阐明。

5 遗传工程介导的神经细胞分化

　　2002年Chung等人［25］将Nurr1（nur相关因子1）基因导入小鼠ES细胞，使其过表达，从而诱导ES细胞分化为具有中脑多巴胺能神经元表型的细胞。Nurr1是一种转录因子，直接结合于TH基因的启动子区域，调节维持中脑多巴胺能神经元表型的蛋白质的表达，如L-芳香族氨基酸脱羧酶（aromatic L-amino acid decarboxylase, AADC）、囊泡单胺转运蛋白2（vesicular monoamine transporter 2, VMAT2）［26］和多巴胺转运蛋白（dopamine transporter, DAT）［27］。将这种方法得到的多巴胺能神经元注射到脑内可以改善帕金森模型大鼠的运动缺陷［28］。该方法存在的问题是，在神经细胞分化之前过表达Nurr1会上调其他多巴胺能神经元分子标志的表达，而且由ES细胞分化的其他细胞也会出现这种情况［29］。

　　2004年Ikeda等人［30］将MASH1基因导入小鼠ES细胞，该ES细胞多数分化为表达βⅢtubulin和泛NCAM（pan NCAM）的神经元样细胞，其中半数进一步分化为Islet阳性的运动神经元。MASH1是一种激活型碱性螺旋-环-螺旋结构的转录因子，表达于腹侧端脑，调节GABA能中间神经元和分支运动神经元的发育［31］。将得到的运动神经元样细胞注射到偏瘫小鼠脑室周围的运动皮层，可明显改善运动障碍。

　　遗传工程介导的神经细胞分化方法的优势是可以较高效率地得到感兴趣的特定的神经细胞。但是由于导入基因的功能多样性和不确定性，较难判断该基因对细胞的整体影响和长远影响。

　　6 问题与展望

　　虽然小鼠胚胎干细胞诱导分化为神经细胞的方法取得了较大进展，目前可以较高效率地得到中枢神经系统的各种神经元和神经胶质细胞，但是仍有许多问题亟待解决。首先，虽然“五步法”方案解决了“4-/4+”方案中分化细胞不易纯化的问题，但是其分子机制尚待进一步阐明、操作步骤需要进一步优化；其次，SDIA诱导方法的作用机制和单层粘附培养的作用机制需要进一步阐明，这将会有利于我们对神经细胞分化过程中信号通路的掌握；再次，遗传工程方法导入的基因对细胞的长远影响需要进一步观察和研究；还有，现在所得到的神经细胞类型还不很明确，因为神经元和神经胶质细胞还可以分为很多亚型。例如中枢神经系统的胆碱能神经元根据形态和生化特性就可以分为不同亚型，它们的分布和生理功能也不尽相同。因此有必要获得特定部位和类型的神经细胞。

　　ES细胞向神经细胞分化的研究有利于人们了解胚胎神经细胞发育的机制、发现ES细胞向神经细胞分化的关键调节基因；建立体外定向诱导神经细胞分化体系将为神经疾病治疗药物的筛选以及基因工程药物的开发等提供有用的材料；体外大量有功能的特定神经元的获得使神经再生医学正一步步从理论走向实践。

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