染料木素的体外抗肿瘤作用研究

作者：戴支凯，黄姣娥，余丽梅，徐庆

【摘要】 　　目的观察染料木素的体外抗肿瘤作用。方法采用溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑(3-［4,5- dimethylthiazol-2-yl］ -2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)检测法测定染料木素对子宫内膜腺癌细胞系（JEC）、人肝癌SMMC-7721细胞系体外增殖的影响，按台盼蓝排染法计数活细胞，绘制细胞生长曲线。结果MTT法检测显示，染料木素对JEC细胞和SMMC-7721细胞增殖的抑制作用呈现剂量和时间依赖性；随染料木素浓度的升高，JEC和SMMC-7721细胞的生长曲线逐渐下移，10-4 mol· L-1的染料木素作用下的JEC细胞生长曲线呈现与5Fu相似的下降趋势。结论染料木素具有一定的抗肿瘤作用。

【关键词】 染料木素 肿瘤 细胞生长

　　Abstract:ObjectiveTo investigate the antitumor effects of genistein on gastric carcinoma cell lines JEC and SMMC-7721 cells in vitro. MethodsCell validity of genistein on JEC and SMMC-7721 cells were measured by MTT reduction test. The number of living cells was counted by trypan blue dye exclusion method and growth curves were drawn according to it.ResultsThe inhibitory percentages of genistein on JEC and SMMC-7721 cells were concentration-dependent and time-dependent in MTT reduction test. Growth curves showed down-shift with concentration increasing. Especially, the growth curve of JEC cells treated with 10-4 mol· L-1 tended to decline gradually and were similar to that of 5Fu. ConclusionGenistein has certain anticancer effect.

　　Key words:Genistein; Carcinoma; Cell growth

　　肿瘤是危害人类健康的最严重的疾病之一，其发病率呈逐年上升的趋势。染料木素原料药系从豆科植物槐角Sophora japonica L.的干燥成熟果实中提取的异黄酮单体成分，是具有弱雌激素样作用又非雌激素类化合物，称之为植物雌激素。流行病学调查［1］、动物实验［2,3］以及体内［4］、体外［5］的研究显示，染料木素具有防治癌症作用。我们就染料木素抗子宫内膜腺癌细胞（JEC）和人肝癌SMMC-7721作用进行了初步探讨。

　　1 材料与方法

　　1.1 MTT检测法

　　1.1.1 肿瘤细胞的传代培养子宫内膜腺癌（JEC，遵义医学院微生物学教研室吴中明教授提供）、人肝癌SMMC7721（中科院上海生命研究院）用含10%小牛血清的RPMI－1640 (Lot #1165062, GIBCO)培养液稀释成1×105· ml－1的细胞悬液，每个培养瓶2 ml，置３７℃、５％ 的CO2环境中进行体外培养，待瘤细胞在培养瓶底长至约８０％ 细胞融合时，分瓶传代培养。

　　1.1.2 分组实验分为空白对照组（NS）、阳性对照组（5-fliorouracil，5Fu，10-4mol·L-1。上海旭东海普药业有限公司，批号：031001），5个10倍梯度的试药组（10-4～10-8 mol· L-1的染料木素，﹥95%，陕西赛德高科生物股份有限公司）和与10-4 mol· L-1的染料木素相对应的溶媒对照组（含0.5%乙醇的NS）。

　　1.1.3 操作用RPMI-1640完全培养液分别将肿瘤细胞稀释配制成5×104· ml－1的细胞悬液，接种于96 孔培养板，每孔100 μl，置37℃,5% 的CO2 环境中，进行体外培养，24 h后加药，每孔10 μl，设5个平行孔，空白对照组加入等量生理盐水；结束培养（24，48，72，96 h）前4 h，每孔加入5 mg· ml－1的MTT溶液10 μl，结束培养后小心吸弃上清液，每孔加入DMSO 150 μl，待甲臢完全溶解后于酶标仪（Sunrise, Australia）570 nm处读出各孔的OD值。实验重复3次。

　　1.1.4 评价指标评价指标为平均细胞抑制率(IR)。细胞抑制率（%）=(1一实验孔OD值/对照孔OD值) ×100％。IR>50％为敏感，在30％～50％为低度敏感，小于30％为不敏感。

　　1.2 台盼蓝排染法及生长曲线的绘制将对数生长期细胞制成浓度为5×104· ml－1细胞悬液，接种于24 孔板，每孔1 ml。置37℃,5%的CO2 环境中培养24 h，再行无血清培养48 h。更换完全培养基，每孔加入药物100 μl（空白对照组加等体积的生理盐水），每组各时间点均设2个平行孔。分别于药物作用1～7 d，消化收集细胞，按台盼蓝排染法，用血细胞计数板在光镜下计数活细胞数。以时间为横坐标，活细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

　　1.3 统计学处理实验所得数据用±s表示，采用t检验进行各组间比较。

　2 结果

　　2.1 MTT检测

　　2.1.1 染料木素对JEC细胞体外增殖的影响MTT检测结果显示，随染料木素浓度的增加和时间的延长，染料木素对JEC细胞生长的抑制作用逐渐增强。结果见表1。其中，10-4 mol· L-1的染料木素作用JEC细胞24，48，72和96 h的抑制百分率分别为36.10%，55.00%，58.73%和62.21%，与5Fu间无显著差异（P>0.05）。表1 染料木素对JEC细胞体外增殖的影响(略)

　　2.1.2 染料木素对SMMC-7721细胞体外增殖的影响MTT检测结果显示，随着染料木素浓度的增加和时间的延长，染料木素对SMMC-7721的抑制作用逐渐增强。结果见表2。表2 染料木素对SMMC7721细胞体外增殖的影响(±略)

　　2.2 染料木素对JEC和SMMC-7721细胞生长的影响

　　2.2.1 染料木素对JEC细胞生长的影响染料木素对JEC细胞的生长曲线显示，随着染料木素浓度的增加，生长曲线逐渐下移，10-4 mol· L-1染料木素的生长曲线呈现与5Fu相似的下降趋势。见图1。

　　2.2.2 染料木素对SMMC-7721细胞生长的影响染料木素对SMMC-7721细胞的生长曲线显示，随着染料木素浓度的增加，生长曲线逐渐下移。见图2。

　　3 讨论

　　MTT检测结果显示，染料木素对JEC和SMMC-7721细胞体外增殖均有不同程度的抑制作用，呈现剂量和时间依赖性。其中，在96 h 10-4 mol· L-1的染料木素对JEC细胞的抑制百分率达62.21%，对SMMC-7721细胞的抑制百分率为31.87%。表明染料木素对JEC细胞敏感，对SMMC-7721低度敏感。该结果与染料木素对胃癌HGC227细胞系［6］、人肺癌细胞A549 和人低分化胃腺癌细胞BGC-823［7］等的抑制作用相似。随着染料木素浓度的增加，JEC和SMMC-7721细胞的生长曲线均逐渐下移。其中，在10-4 mol· L-1的染料木素作用下，JEC细胞的生长曲线呈现与5Fu相似的下降趋势，进一步表明染料木素具有一定的抗肿瘤作用。

　　染料木素是一种很有潜力的癌症化学预防剂，来源丰富，作用复杂，受到广泛关注。研究表明，染料木素具有雌激素作用、抗氧化作用以及抑制拓朴异构酶活性、抑制酪氨酸蛋白激酶活性、诱发细胞程序性死亡、抑制血管生成［2］等作用，但仍不能完全阐明其作用机制。染料木素抗肿瘤的机制有待深入研究。

【参考文献】
　　［1］Wiseman H. Role of Dietary Phyto-oestrogens in the Protection Againest Cancer and Heart Disease［J］.Biochem Soc Trans. 1996, 24(3): 795.

　　［2］郑杰.金雀异黄素［J］.国外医学·卫生学手册, 1998, 25(5):260.

　　［3］Pollard M，et al. Influence of Isoflavones in Soy Protein Isolates on Development of Induced Prostate-related Cancers in L-W Rats［J］.Nutr-Cancer.1997, 28(1): 41.

　　［4］张义, 赵春燕, 孙亚芹，等.大豆异黄酮的抗肿瘤研究［J］.长春中医学院学报，2006，24（1）：60.

　　［5］Ann R Kennedy: The Evidence for Soybean Products as Cancer Preventive Agents［J］.J. Nutr. 1995, 125:733.

　　［6］Matsukawa Y, M arui N , Sakai T, et al. Genistein arrests cell cycle progression at G2-M［J］.Cancer Res, 1993, 53 (6) : 1328.

　　［7］马磊, 楼凤昌.槐角中的抗癌活性成分［J］.中国天然药物，2006，4（2）：151.