地黄饮子含药脑脊液对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤即早基因c-fos和c-jun表达的影响

【摘要】 　　目的探讨古方地黄饮子对β淀粉酶Aβ25～35所致PC12细胞损伤时即早基因c-fos和c-jun表达的调控作用。方法把离体培养的进入对数生长期的PC12细胞分为空白组、模型组、VitE脑脊液对照组、地黄饮子脑脊液低、中、高剂量组，待24 h细胞贴壁后吸去培养液,6组分别加入正常培养液、正常脑脊液、VitE脑脊液、地黄饮子脑脊液低、中、高剂量，加培养液补至等量，37℃孵育2 h。然后除正常组加入等量培养液外，其他各组加入经老化处理的Aβ25～35（终浓度为10 μmol/L），继续孵育24 h，然后离心收集细胞，提取总RNA。应用RT-PCR二步法和琼脂糖凝胶电泳方法测定c-fos和c-jun基因的表达。结果地黄饮子能下调c-fos和c-jun基因的表达，并呈一定的剂量依赖性。结论地黄饮子脑脊液能明显降低PC12细胞受Aβ25～35刺激时即早基因c-fos和c-jun的过度反应，说明地黄饮子能提高PC12细胞对外界不良刺激的应激性。

【关键词】 地黄饮子 脑脊液 PC12细胞 即早基因

　　Abstract:ObjectiveTo investigate the regulative effects on the expression of IEG c-jun and c-fos of Decoction of rehmanniae on PC12 injury induced by b-amyloid25～35 protein(Aβ25～35).MethodsCultured cells of PC12 were pided into 6 groups:normal group,model group,vitamin E group,low dose of TCM group,moderate dose of TCM group and high dose of TCM group.Six groups were respectively added to normal cultured fluid;nomal cerebrospinal fluid,vitE cerebrospinal fluid,low dose of TCM cerebraspinal fluid, moderate and high dose of TCM cerebrospinal fluid in log growth phase,then added cultured fluid to equal,37℃ hatched 2 hours.The normal group was added to the same dose of cultured fluid and other groups were added to Aβ25～35 dealed with aging (the final concentration is 10 μmol/L),and then six groups were hatched 24 hours together.At last they were centrifuged to extract the total RNA. The expression of c-jun and c-fos measured by the methods of RT-PCR and agarose gel electrophoresis.ResultsThe group of Decoction of Rehmanniae cerebrospinal fluid reduced the expression of c-jun and c-fos gene, and showed some dose-dependence.ConclusionDecoction of Rehmanniae cerebrospinal fluid can effectively reduce the high response of c-jun and c-fos gene in PC12 cells injured by Aβ25～35.It shows that Decoction of Rehmanniae cerebrospinal fluid can increase PC12 cells' irritability for external ill innervation.

　　Key words:Decoction of Rehmanniae; Cerebroapinal; Pheochromocytomaderived cell line(PC12 cells); Immediate Early gene

　　属于神经嵴源细胞之一的PC12 细胞与原代培养的细胞相比，同源性较好且较易获取，细胞生存时间长,易于观察。而淀粉样蛋白在老年性痴呆（阿尔茨海默病，Alzheimei' s Disease,AD）患者脑中普遍沉积，由其诱导的PC12细胞的凋亡模型即为老年性痴呆病的一个较贴近的模型。

　　即早基因(Immediate early gene,IGE)又称快反应基因、原癌基因(proto-oncogers),该基因家族有包括c-fos和c-jun在内的近百个成员。c-fos和c-jun在正常情况下参与细胞的生长、分化、信息传递、学习和记忆等生理过程，在遭受多种刺激因子，如缺血、缺氧、光线刺激、机械刺激、疼痛刺激等时可被快速诱导过度表达。本实验探讨古方地黄饮子对β淀粉酶（Aβ25～35）所致PC12细胞损伤时即早基因c-fos和c-jun表达的调控作用。

　　1 材料与仪器

　　1.1 细胞及动物PC12细胞购自中科院上海生物细胞研究所。大耳白家兔，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

　　1.2 地黄饮子组成由熟地、山萸肉、肉苁蓉、石斛、麦冬、五味子、石菖蒲、远志、茯苓、肉桂、炮附子、巴戟天、薄荷等组成（由哈尔滨市松茂药行提供）。

　　1.3 材料

　　Aβ25-35（sigma）,DMEM培养基、胰蛋白酶（Hyclone）,5%胎牛血清（杭州四季青生物制品有限公司），VitE（大连南美制药有限公司），引物、DNA marker（大连宝生物），Advantage R7-for-PCR kit (clontech)中药饮片由黑龙江中医药大学提供。

　　1.4 仪器

　　稳压稳流电泳仪：DYY-8，上海琪特分析仪器有限公司。紫外凝胶成像系统：Labworks 4.5 UVP Ltd.Cambridge，UK。PCR扩增仪：Apllied Biosystems 2700 PE,Singarpore。

　　2 方法

　　2.1 PC12细胞的培养方法

　　PC12细胞培养于含10%胎牛血清（56℃灭活30 min）DMEM的培养液中，并加入100 U/ml链霉素，100 U/ml青霉素。细胞接种于培养瓶中，在37℃，5%CO2/95%空气，饱和湿度的培养箱中培养。2 d换液1次，3～4 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

　　2.2 中药脑脊液的提取方法

　　2 kg重大耳白家兔，适应性喂养3 d，灌胃给服地黄饮子水煎剂、VitE(0.21 g/ml，吐温80助溶于蒸馏水中)水溶液，灌服药量均按成人量10倍给药，空白组给服等体积的蒸馏水。灌胃后1 h，戊巴比妥钠静脉麻醉，于无菌条件下在枕骨大孔处垂直进针，抽取200 μl脑脊液，并补充等量等生理盐水，以上步骤连续3 d，将3 d获得的同一家兔的脑脊液混合，-70℃冻存备用。

　　2.3 分组及建立模型

　　离体培养进入对数生长期的PC12细胞分为6组：空白对照组（简称空白组）、模型对照组（简称模型组）、VitE组（简称西对组）、地黄饮子低剂量组（简称中低组）、地黄饮子中剂量组（简称中中组）、地黄饮子高剂量组（简称中高组）。待24 h细胞贴壁后吸去培养液，分别加入空白培养液10%、正常脑脊液10%、VitE脑脊液10%、中药脑脊液低剂量5%、中剂量10%、高剂量20%。加培养液补至等量，37℃孵育2 h。然后除空白组之外的各组加入经老化处理的Aβ25-35（终浓度为10 μmol/L），建立AD细胞模型。空白组加入等量的培养液，继续孵育24 h后将细胞吹打至悬浮状，离心收集细胞，提取总RNA。2.4 RT-PCR检测c-fos和c-jun基因的表达

　　采用Trizol提取RNA。逆转录体系参照RT-PCR二步法（Advantage RT-for-PCR Kit, Clontech）。

　　引物设计由美国NCBI数据库提供RNA全序列，用primer3引物设计软件设计。

　　Rat c-fos：left primer，5＇CAGCCTTTCCTACTACCAT 3＇right primer 5＇ CTTATTCCTTTCCCTTCG 3＇(产物为370bp)；

　　Rat c-jun：left primer，5＇ AGCAATGGGCACATCACC 3＇right primer 5＇ TCTGCGGCTCTTCCTTCA 3＇(产物为451bp)；

　　β-actin:

　　left primer:5＇ TGTGATGG TGGGTATGGG3＇
　　right prmer:5＇ TAGAAGCATTTGCGGTGC3＇(产物为500 bp)

　　聚合酶链式反应（PCR）条件：cDNA 2.0 μl,dNTP2.0 μl,10×RT buffer 2.5 μl, 上下游引物（20 μmol/L）各0.5 μl，Taq酶0.25 μl, 加去离子水至25 μl。反应参数：95℃2 min；94℃1 min，55℃45s，72℃45s，25个循环；74℃延伸10 min。β-actin 的反应参数为95℃5 min；94℃1 min，55℃1 min，74℃1 min，25个循环；74℃延伸10 min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳下分离检测。凝胶成像分析系统进行拍照和分析扩增产物电泳强度，以上实验重复3次，取平均值。

　　3 结果

　　3.1 地黄饮子含药脑脊液对PC12细胞c-fos基因表达的调控作用见图1及表1。表1 地黄饮子对PC12细胞c-fos mRNA表达的影响（略）

　　结果显示，模型组与空白组比较，c-fos mRNA表达明显增加（P＜0.01），而加入地黄饮子含药脑脊液后可显著降低c-fos mRNA表达（P＜0.05 或P＜0.01），且地黄饮子高剂量组优于VitE对照组（P＜0.01）。

　　与模型组比较，*P＜0.05；**P＜0.01；与对照组比较，△P＜0.05；n=3

　　3.2 地黄饮子含药脑脊液对PC12细胞c-jun基因表达的调控作用见图2及表2。表2 地黄饮子对PC12细胞c-jun mRNA表达的影响（略）

　　与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照组比较，△P＜0.05；n=3

　　结果显示，Aβ25-35损伤模型组与空白组比较，c-jun mRNA表达明显增加（P＜0.01），经治疗后，各组c-jun mRNA表达均有所下降（P＜0.05或P＜0.01），且地黄饮子高剂量组优于VitE对照组。

　　RT-PCR结果显示，地黄饮子含药脑脊液能够下调c-fos和c-jun基因的表达,并呈一定的剂量依赖性,其表达水平低于VitE。电泳强度比较显示，模型组>地黄饮子脑脊液低剂量组> VitE对照组>地黄饮子脑脊液中剂量组>地黄饮子脑脊液高剂量组>空白组结果见表1～2。

　　4 讨论

　　老年性痴呆（Alzheimei' s Disease, AD）的发病机制尚未明了，脑内突出病理表现为老年斑，淀粉样蛋白的沉积是老年斑的主要成分，是由正常存在于细胞膜上的β,γ分泌酶作用下水解形成的相对分子质量为 4 000 左右的蛋白［1～2］。近年来，已经证实与AD发病有关的基因突变(APP基因，PS-1基因，PS-2基因A )以及载脂蛋白E基因等，都可导致Aβ的异常沉积，Aβ对体外培养及在体神经细胞有损伤作用，因此越来越多的学者都以Aβ作为研究AD的关键。

　　PC12细胞株是目前研究神经细胞的良好模型，与原代培养的细胞相比，细胞的同源性较好且较易获取。而淀粉样蛋白在AD患者脑中普遍沉积，由其诱导的PC12细胞的凋亡模型即为老年性痴呆疾病的一个较贴近的模型。

　　c-jun和c-fos同属即早基因(Immediate Early Gene,IEG)。c-fos基因作为早期反应基因,在正常情况下参与细胞的生长、分化、信息传递、学习和记忆等生理过程。研究认为［3］,c-fos可作为细胞兴奋和细胞损伤进展的标志，c-fos与神经细胞凋亡在分布、时程和数量上具有一定的相关性,且c-fos表达的时间在细胞凋亡发生形态及生化变化之前［4］。在正常情况下,中枢神经系统某些部位的神经细胞可有c-fos，c-jun基础水平的表达,但水平较低,不容易检测到;然而中枢神经组织受到撞击性刺激或缺血、缺氧等多种不同的生理和病理性刺激时，神经细胞被诱导发生c-fos，c-jun快速、短暂、高水平的表达［5，6］。

　　研究发现, Aβ诱导神经元内氧自由基增加,导致c-fos和c-jun被诱导过度表达。Anderson等［7］发现在Aβ处理神经元2 h后c-fos表达最高，4 h后仍呈现高表达并延续较长时间，24 h后c-jun阳性神经元拒染苔酚蓝，说明细胞已开始凋亡。本实验证明, Aβ可致PC12细胞损伤,诱导c-fos，c-jun的高表达。

　　地黄饮子可以通过调节SOD，CAT和GSH-Px这些抗氧化酶的活性起到间接的抗氧化作用,提高CAT和GSH-Px协同作用以使细胞内H2O2浓度保持在稳定水平。因此，地黄饮子脑脊液有效成分可以通过提高抗氧化酶活性消除自由基的产生,避免诱发c-fos和c-jun的表达,抑制细胞凋亡。此调控效应与含药脑脊液的浓度密切相关，其中高、中剂量的地黄饮子含药脑脊液对抑制c-fos和c-jun的表达能够取得较好的效果。

【参考文献】
　　［1］Giltter BD, Boggs LN, May PC, et al. Regulation of cytokine secretion and amyloid precursor protein pro-cessing by proinflammatory amyloid beta(A beta)［J］. Ann NY Acad Sci,2000，91(7):154.

　　［2］刘春善，黄耀德. 阿尔茨海默病中针对β淀粉样蛋白治疗的进展性研究［J］.中国临床康复，2003，7（28）：3867.

　　［3］Dragunow M, Robertson HA, Brain injury induces c-fos protein(s) in nerve and glial-like cellsin adult mammalian brain［J］.Brain Res,1988,455(2):295.

　　［4］田金州,时 晶,高 扬,等.大鼠短暂脑缺血后海马区c-fos mRNA和FOS蛋白表达的时间规律［J］.卒中与神经疾病,2003,10(3):131.

　　［5］田伟,李立新,郭实士.湖南汉族群体HLADR2等位基因多态性与系统性红斑狼疮的相关性研究［J］.湖南医科大学学报,2000,25(1):15.

　　［6］区宝祥,阮华业,方 燕,等.广州地区HLAA,B,C,DR与鼻咽癌关联的研究［J］.癌症,1985,4(1):5.

　　［7］Anderson AJ, et al . Differential in duction of immediate early gene prote insinculture neurons by β amyloid: association of c-jun with Ａβ induced apaptosis［J］.J Neurochem, 1995,65: 1487.