川芎嗪对小鼠化学性肝损伤的实验研究

【摘要】 　　目的研究川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对小鼠化学性肝损伤的作用及其可能机制。方法采用在体和离体两种方法观察: 在体以D-氨基半乳糖（D-galactosamine,D-Gal） 诱导小鼠急性肝损伤模型,测定各组肝损伤小鼠血清谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase,GPT) 、谷草转氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase;GOT) 活性,及肝组织丙二醛(malondialdehyde,MDA) 、黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase ,XOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase , GSH-PX) 、一氧化氮(nitrogen monoxidum ,NO) 、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthetase ,NOS) 、诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase ,iNOS) 含量。体外实验采用小鼠离体肝细胞原代培养,并建立CCl4 诱导肝细胞坏死性损伤模型,检测TMP 对其的影响。结果TMP能显著降低小鼠血清中升高的GPT，GOT，降低XOD 活力和过氧化物终产物MDA 的含量。对氧化应激引起的肝脏GSH 含量下降具有升高作用。TMP 可以显著降低离体培养中染毒肝细胞中的GPT水平。结论 提示TMP对小鼠化学性肝损伤具有显著的保护作用。

【关键词】 川芎嗪 肝损伤 肝原代培养细胞

　　川芎嗪为中药川芎的有效成分，化学结构为四甲基比嗪（Tetramethylpyrazine ，TMP）, 被广泛应用于心脑血管闭塞性疾病的治疗［1］。川芎嗪有解痉、降压、扩张血管等广泛的生物作用。川芎嗪在肝细胞方面的研究尚少见报道。有研究表明［2］，川芎嗪能减轻大鼠肠缺血再灌注所致肝脏损伤。其机制与减少大鼠脂质过氧化,改善ATPase功能有关。本实验采用了体内给药以及建立体外模型两种方法观察TMP对小鼠急性肝损伤的保护作用。在体实验主要从体内降酶和抗脂质过氧化、抑制NO等方面研究TMP对肝损伤的治疗作用。离体采用体外小鼠原代细胞模型,排除神经和体液因素的影响,观察TMP对CCl4 染毒的小鼠肝细胞的保护作用,进一步探讨TMP 及阳性对照药物的膜保护作用机制，以便为临床用药提供参考。

　　1 材料与方法

　　1. 1 动物　

　　昆明种小鼠,雌雄兼用,体重21～24 g（荆门职业技术学院实验动物中心提供）。

　　1. 2 药品与试剂　

　　川芎嗪注射液40 mg/2ml，（北京第四制药有限公司生产，批号：200503020），D-半乳糖胺( D-Gal)，重庆医科大学提供，批号：051215 ，四氯化碳(CCl4 )，分析纯,南京化学试剂一厂生产，批准文号：GB32226；生化检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所提供；刀豆蛋白A (Concanavalin A , Con A ,Sigma)；噻唑蓝(MTT , Sigma)； 胶原酶(Collagenase ,475 U·mg-1) 为Sigma 产品；二甲基亚砜(DMSO , 苏州正兴化工厂) ；乙二醇- 双(α-氨基乙基)-醚-四乙酸(HEPES) 均购自和光纯药药工业株式会社。

　　1.3 动物分组

　　昆明小鼠随机分为5组,每组10只。分别为①正常对照组:生理盐水20 ml·kg- 1；②模型组:生理盐水20 ml·kg- 1； ③TMP高剂量组:800 ml·kg- 1；④中剂量组400 ml·kg- 1；⑤低剂量组200 ml·kg- 1，灌胃1次/d,连续给药7 d。于末次给药1 h后,除正常对照组外, 其他各组小鼠均腹腔注射10% D-Gla (800 mg·kg-1 ) 。禁食不禁水,16 h 后由球后静脉丛取血,分离血清备测GPT，GOT。处死小鼠后,取肝称重并计算肝系数(肝脏湿重与体重之比) 。

　　1.4 血清酶活性测定　

　　分离血清后用赖式改良法测GPT，GOT;称取肝脏总重量,测肝重系数变化。

　　1.5 肝组织匀浆酶活性测定　

　　用考马斯亮蓝法(试剂盒) 测定蛋白质含量,用硫代巴比妥酸法(试剂盒)测定丙二醛(MDA) 含量,用紫外分光光度法(试剂盒) 测定黄嘌呤氧化酶(XOD) 活性,用二硫双硝基苯甲酸显色法(试剂盒) 测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX) 活性,用硝酸还原酶法(试剂盒)测定一氧化氮(NO) 。

　　1.6 肝细胞分离　　

　　小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉,用70%的酒精棉球消毒小鼠体表后,背位固定。再次用酒精棉球消毒其腹部,腹正中V形切口,使腹腔充分暴露,门静脉插管并固定,向肝脏灌注37 ℃预温的前灌流液( 无钙镁Hank 's 平衡盐溶液, 内含0. 5 mmol·L- 1 EGTA、25 mmol·L- 1HEPES ,pH 7.4) 。同时打开后腔静脉,尽量冲尽肝组织中残血,然后打开胸腔,剪断前腔静脉,结扎后腔静脉。再用37 ℃预温的灌流液(含0.1%胶原酶、4 mmol·L- 1CaCl2，0.8 mmol·L- 1 MgSO4 的HBSS) 继续灌流,控制流速约6 ml·min- 1，持续灌流数分钟后,待肝组织韧性消失,轻压不易恢复,停止灌流。立即将肝脏置于含完全培养基的培养皿中,用含10-6 mol·L- 1胰岛素和10 - 6 mol·L- 1地塞米松的无血清RPMI-1640 培养基冲洗2～3次后,将肝脏转入另一盛有含胰岛素和地塞米松的RPMI-1640 培养基的平皿中,用眼科镊去除肝包膜,轻轻抖动,分散肝细胞,将此肝细胞悬液用100目滤网过滤,滤液以50×g 离心2 min ,弃上清,沉淀为肝实质细胞(hepatocytes ,HC)［3］。

　　1.7 CCl4 致肝损伤与转氨酶的释放实验　

　　在96孔培养板中加入上述分离的肝细胞,每孔细胞数为2×104 ,于37 ℃, 5 % CO2 培养4 h, 肝细胞单层用William's E 培养液洗涤2 次,加药预培养3 h ,弃上清,再加入CCl4 (0. 15 %) 和药物共培养2 h 或只加CCl4 培养2 h，吸取上清测谷丙转氨酶活力［4］。

　　1.8 统计方法　

　　用SPSS 10.0 软件包处理数据。各项数据均以表示,多组计量资料均数比较采用单因素方差分析。并进行组间两两比较,方差齐用LSD法,方差不齐采用Dunnett's T3 法比较, P< 0.05 为差异具有统计学意义。　2 结果

　　2.1 DGLL 对D-Gal 所致肝损伤小鼠血清酶水平的影响　

　　与对照组相比,模型组的肝脏指数有极显著的增加(P < 0.01)TMP高、中剂量组使升高的肝脏系数极显著地降低(P< 0.01)。与模型组相比,TMP高、中剂量组小鼠血清中GPT ，GOT水平均显著下降(P< 0.01)。结果见表1。表1 TMP对D-半乳糖胺所致肝损伤小鼠血清酶水平的影响(略)

　　2. 2 TMP 对D-Gal所致肝损伤小鼠肝匀浆中MDA、XOD 和GSH 水平的影响　

　　模型组肝匀浆MDA水平及XOD活力与正常组相比明显升高 (P< 0.01) ,TMP高、中、低剂量组中,肝匀浆MDA水平明显降低 (P< 0.01)，TMP高、中、低给药组动物肝匀浆中XOD活力与模型组相比, 明显降低；与对照组相比,模型组肝匀浆GSH 水平也明显降低 ( P< 0.01) , TMP高、中剂量组升高肝匀浆中降低的GSH 活力, TMP低剂量给药组未见明显效果。结果见表2。表2 TMP对D-半乳糖胺所致肝损伤小鼠肝匀浆中MDA，XOD 和GSH水平的影响(略)

　　2.3 TMP对D-Gal所致肝损伤小鼠肝匀浆中NO，NOS和iNOS水平的影响　

　　模型组肝匀浆NO，NOS，iNOS 水平与正常组相比明显升高(P<0.01)， TMP高，中剂量组均可显著降低肝匀浆中升高的NO，NOS，iNOS 含量，TMP低剂量组未见明显作用。见表3。表3 TMP对D-半乳糖胺所致肝损伤小鼠肝匀浆中NO，NOS 和iNOS 水平的影响（略）

　　2.4 形态学观察　

　　对照组肝细胞形态无明显改变,细胞界限清晰。CCl4 损伤后,肝细胞经台盼蓝染色显示,细胞活性明显降低,在显微镜下,可见细胞膜不规则,有皱缩现象TMP组及各给药组细胞形态明显好于模型组。

　　2.5 DGLL 对CCl4 损伤肝细胞GPT的影响　

　　CCl4损伤肝细胞后,促进肝细胞内酶的释放,模型组的GPT 水平较对照组明显升高。与模型组相比TMP各剂量组均能显著抑制GPT水平的升高, 在与上述相同的浓度下,均可剂量依赖性地降低GPT浓度。见表4。表4 TMP对CCl4 损伤肝细胞ALT的影响(略)

　　3 讨 论

　　体内实验中采用D-Gal腹腔注射导致小鼠急性肝损伤,实验中模型组小鼠血清GPT，GOT 水平明显升高,与正常对照组比较均有明显改变,提示本实验造成了小鼠急性肝损伤［5］。本实验结果表明，TMP可降低产生氧自由基酶系的活力,如可降低XOD 活力和过氧化物终产物MDA 的含量。MDA 可间接反映机体细胞受自由基攻击的程度,显示细胞损伤的程度。同低剂量组相比高剂量组降低MDA的含量优于低剂量组,提示TMP高、中剂量较低剂量具有更强的减轻脂质过氧化反应的作用,减轻过氧化作用对细胞膜，RNA 和蛋白质等的攻击,从而改善由过氧化反应引起的肝损伤［6］。GSH广泛存在于人体的各种组织中。GSH 水平降低意味着机体抗氧化能力下降并引发机体的氧化应激反应,因此自由基生成大量增加。从本实验可以看出,与对照组相比,模型组肝匀浆GSH 水平显著降低,提示在肝脏化学性损伤时,氧化应激消耗GSH引起肝脏GSH 含量下降,机体抗氧化能力下降并引发机体的氧化应激反应,因此自由基生成大量增加。TMP处理后肝脏GSH 之所以明显高于肝损伤组。可能与下述机制有关：①减轻氧化应激的程度使其低于肝损伤模型组; ②增强组织、细胞的抗氧化能力,减弱氧化应激反应导致的肝损伤。本实验用D-Gal 致急性肝损伤后,模型组肝匀浆iNOS 水平与正常组相比显著升高,同时模型组肝匀浆NO水平也明显升高,这些主要由iNOS 诱导产生的NO 在肝损伤中主要起毒性作用。本实验结果提示TMP 组显著降低肝匀浆中升高的NO ,从而减轻肝脏组织中高水平的NO 对肝组织的毒性作用,且TMP 高剂量组较中剂量组小鼠肝组织中NO浓度进一步降低,提示TMP对肝组织中NO 浓度降低在一定范围内与剂量呈正相关。CCl4 中毒引起的动物GPT升高水平与肝细胞损伤程度呈平行关系［7］，转氨酶升高在一定程度上反映了肝细胞的损伤程度［8］。本实验中我们采用原代培养肝细胞的方法,建立了CCl4 诱导肝细胞坏死性损伤模型。CCl4 染毒2 h ,表明CCl4 是通过早期溶膜作用而破坏膜结构,细胞膜受损,通透性增加,细胞内GPT，K+ 顺浓度梯度而漏出。分离正常小鼠的HC ,预培养后加入不同浓度的药物共培养4 h ,洗去药液后加入CCl4共培养。结果与HC 的GPT 自动释放值相比,CCl4 加入后引起原代肝细胞损伤,导致HC 释放GPT显著增加,而TMP及各组药物对CCl4 引起的肝细胞损伤均呈现不同程度的保护作用,有明显的量效关系。提示：TMP具有抗CCl4 损伤小鼠肝细胞后的脂质过氧化作用和脂质膜稳定作用。有保护肝细胞和溶酶体膜结构作用。

　　综上所述, TMP在降酶、抗脂质过氧化、抑制细胞因子NO等方面都表现出了很重要的作用。同时体外实验排除了TMP通过神经和体液因素所起的间接作用,从细胞水平证实TMP对CCl4所致的肝脏损伤有一定的保护作用。

【参考文献】
　　［1］杨光田, 李树生, 邓普珍, 等. 实验动物复苏及缺氧时川芎嗪对心脑的作用［J］.中国急救医学, 1997, 17 (1) ：7.

　　［2］高卉,阮明凤,白育庭，等.川芎嗪对大鼠肠缺血再灌注肝损伤保护作用的实验研究［J］.时珍国医国药，2006，17（8）：1479.

　　［3］Wu FH , Cao JS , Jiang JY. Ruscogenin glycoside (Lm-3) isolated from Liriope muscari , improves liver injury by dysfunctioning liver infiltrating lymphocytes ［J］.J Pharm Pharmacol ,2001 ，53（2）：681.

　　［4］Kiso Y,Tohkin M,Hikino H. Assay method for antihepatotoxic activity using carbon tetrachloride induced cytotoxicity in primary cultured hepatocytes［J］.Planta Med ,1983 ，49（3：222 .

　　［5］邹丽宜，吴铁，崔 燎. 四氯化碳对大 鼠肝毒性的时量关系研究［J］.中国临床药理学与治疗学,2003，26（8）:158.

　　［6］杨错,刘玉兰,张红梅. 肝细胞损伤机制及防治药物研究进展［J］.实用药物与临床, 2005，24（8）:44 .

　　［7］马学惠,赵元昌,君 镭,等. 齐墩果酸防治实验性肝损伤作用的研究［J］.药学学报，1982，17（3）：93.

　　［8］叶维法. 临床肝胆病学［M］.天津： 科学技术出版社，1998：334.