复方川乌止痛贴剂中酯型生物碱及总生物碱的含量测定

【摘要】  　　目的制定复方川乌止痛贴剂中酯型生物碱及总生物碱的含量测定方法。方法分别采用改良异羟肟酸铁－高氯酸铁法及酸性染料比色法测定制剂中的酯型生物碱及乌头类总生物碱的含量。结果酯型生物碱在6.4～64 mg/ml间有良好的线性关系；平均加样回收率为99.7%，RSD为2.25%（n＝5）。乌头总生物碱在1.94～15.52 mg/ml间有良好的线性关系；平均加样回收率为99.47%，RSD为2.07%（n＝5）。结论结果准确，重复性好，可用于该制剂中酯型生物碱及总生物碱的质量控制。

【关键词】  复方川乌止痛贴 酯型生物碱 总生物碱

　　Abstract:ObjectiveTo establish the assay of ester-series alkaloid and total alkaloid in Complex Prescription Monkshood Plaster. MethodsFerric Hydroxamic acid―Ferric Perchloric acid method was used to determine the content of ester-series alkaloid, and acid dye colorimetry was used to determine the content of total alkaloid in Complex Prescription Monkshood plaster. ResultsA good linearity for ester-series alkaloid was ranged from 6.4 to 64 mg/ml；the average recovery was 99.47% with RSD 2.07%(n=5). Total alkaloid also showed a good linear correlation in the range of 1.94～15.52 mg/ml. The average recovery was 102.06% and RSD was 1.31%(n=5). ConclusionThe result is accurate and the reproducibility is good. These methods can be used for quality control of ester-series alkaloid and total alkaloid.

　　Key words:Complex Prescription Monkshood Plaster；  Ester-series alkaloid；  Total alkaloid
   
　　川乌是毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx. 的干燥母根［1］，其炮制品制川乌是复方川乌止痛贴剂中的主要组成药物，功能祛风除湿，温经止痛。制川乌用于制剂中，既要检查酯型生物碱的含量，以保证临床用药的安全性，同时又要测定乌头类总生物碱的含量［2］，以保证其有效性。本实验对复方川乌止痛贴剂中的酯型生物碱及总生物碱均进行了研究。

　　1  仪器与试剂
   
　　日本岛津UV-2401紫外分光光度计。制川乌（产地：四川）购自江西中药饮片厂，经南京中医药大学生药学教授陈建伟进行品种鉴定。
   
　　乌头碱对照品（购自中国药品生物检定所，供含量测定用，批号：110720-200409）。
   
　　3批中试产品由某制药厂提供。所有试剂均为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  酯型生物碱的含量测定

　　2.1.1  检测波长的选择精密称取乌头碱对照品10 mg，用无水乙醇定容于10 ml量瓶中，精密量取标准溶液1 ml，置于25 ml量瓶中，加无水乙醇使成2.5 ml，精密加入碱性盐酸羟胺试液1.5 ml，摇匀，在60～65℃水浴中保温10 min，放冷，加高氯酸铁试液13 ml ，摇匀，放置5 min，精密加入高氯酸试液8 ml，用高氯酸铁试液稀释至刻度，摇匀，放置15 min后，经紫外分光光度计在200～800 nm对其进行扫描，确定最大吸收波长为510 nm。见图1。

　　图1  改良异羟肟酸铁-高氯酸铁-乌头碱离子对溶液全波长紫外扫描图（略）

　　2.1.2   对照品溶液的制备精密吸取乌头碱对照品10 mg，置10 ml量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度。

　　2.1.3   供试品溶液的制备本品去除被衬后，粉碎，精密称定10g，精密转移入具塞锥形瓶，加入pH3～4的无水乙醇150 ml，浸渍1 h后，超声30 min，离心。取上清液，回收乙醇后，用10 ml 0.6 mol/L的HCl分次转移入分液漏斗中，乙醚萃取3次（20,10,10 ml），取酸水层，加氨试液调pH值至9，氯仿提取3次（10,10,10 ml），合并氯仿层，蒸干。残渣加无水乙醇适量使溶解，转入5ml量瓶中，用无水乙醇分次洗涤容器，洗涤液并入量瓶中，再加无水乙醇至刻度，摇匀。精密量取上述溶液及无水乙醇各2.5 ml，置25 ml量瓶中，各精密加入碱性盐酸羟胺试液1.5 ml，摇匀，在60～65℃水浴中保温10 min，放冷，加高氯酸铁试液13 ml，摇匀，放置5 min，精密加入高氯酸试液8 ml，用高氯酸铁试液稀释至刻度，摇匀，即得。

　　2.1.4   线性关系考察 精密量取浓度为1.024 mg/ml的对照品溶液0，0.25，0.50 ，1.0 ，1.5 ，2.0 ，2.5 ml，分别置于25 ml量瓶中，均加无水乙醇使成2.5 ml，各精密加入碱性盐酸羟胺试液1.5 ml，摇匀，在60～65℃水浴中保温10 min，放冷，加高氯酸铁试液13 ml ，摇匀，放置5 min，精密加入高氯酸试液8 ml，用高氯酸铁试液稀释至刻度，摇匀，放置15 min，照分光光度法（附录ⅤB）在520 nm的波长处测定吸收度，以浓度为纵坐标，吸收度为横坐标，绘制标准曲线C=8.824A-3.746（r=0.999 8）。结果表明本品溶液在浓度6.4～64 mg/ml 范围内吸收度A与浓度C呈良好的线性关系。

　　2.1.5  精密度考察取浓度为1.024 mg/ml的对照品供试液，在520 nm的波长处，每次间隔约30 min，连续6次测定吸收度，计算其RSD＝0.28%。

　　2.1.6   重复性考察取去除被衬后的同一批号样品适量，精密称定5份，按供试品溶液的制备方法制得供试液。分别测定吸收度，测得酯型生物碱的平均含量为0.115 1 mg/g，RSD=2.60%。

　　2.1.7  稳定性考察取去除被衬后的同一批号样品适量，精密称定5份，按供试品溶液的制备方法制得供试液。每间隔1 h，测定吸收度，连续考察7次，测得RSD＝0.4%（n＝7）。2.1.8   加样回收率考察取去除被衬后的同一批号样品适量，精密称定5 g，计5份，精密转移入具塞锥形瓶，各精密加入浓度1.024 mg/ml的对照品溶液0.5 ml，放置10 min，用与“供试品溶液制备”项下相同方法制得供试液。按“样品含量测定”项下方法测定，并按下式计算加样回收率。结果见表1。
   
　　加样回收率（%）=［（测得量-原有量）/加入量］×100%

　　表1  加样回收率实验结果（略）

　　2.1.9   样品含量测定取3个批号的样品，去除被衬后，精密称定10 g，各3份，加10%的微粉硅胶，粉碎，精密转移入具塞锥形瓶，用与 “供试品溶液制备”项下相同方法制得供试液。采用“随行外标二点法”，求得随行标准曲线。将已制备供试品溶液于波长520 nm处，依次测定吸收度，从该标准曲线上读出浓度，计算，即得。结果见表2。

　　表2   样品的酯型生物碱含量测定结果（略）

　　2.2   总生物碱的含量测定

　　2.2.1  检测波长的选择精密吸取乌头碱对照品4 mg，置50 ml量瓶中，用氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1 ml，置分液漏斗中，精密加入氯仿至10 ml，再精密加入pH3.0醋酸盐缓冲液10 ml和0.1%溴甲酚绿溶液2 ml，强力振摇5 min，静置20 min，分取氯仿层，剩余溶液再用氯仿萃取两次（10，5 ml），合并氯仿层，于干燥滤纸滤过，滤液用氯仿定容至25 ml。经紫外分光光度计在200～800 nm对其进行扫描，确定最大吸收波长为413 nm。见图2。

　　图2  溴甲酚绿溶液-氯仿-乌头碱离子对溶液全波长紫外扫描图（略）

　　2.2.2  对照品溶液的制备精密吸取乌头碱对照品4 mg，置50 ml量瓶中，用氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀，制得对照品溶液（C=0.077 6 mg/ml）。

　　2.2.3  供试品溶液的制备本品去除被衬后，精密称定5 g，精密转移入具塞锥形瓶，加入pH值3～4的无水乙醇150 ml，浸渍1 h 后，超声30 min，离心。取上清液，回收乙醇后，用10ml 0.6 mol/L HCl 转移入分液漏斗中，乙醚萃取3次（20,10,10 ml），取酸水层，加氨试液调pH值至9，氯仿提取3次（10,10,10 ml），合并氯仿层，蒸干。105℃放置30 min，取出，放冷，残渣加氯仿适量使溶解，转入10 ml量瓶中，用氯仿分次洗涤容器，洗涤液并入量瓶中，再加氯仿至刻度，摇匀。再将其精密转入分液漏斗中，按标准曲线制备项下的方法，精密加入pH3.0醋酸盐缓冲液10 ml和0.1%溴甲酚绿溶液10 ml，强力振摇5 min，静置20 min，分取氯仿层，剩余溶液再用氯仿萃取两次（10，5 ml），合并氯仿层，于干燥滤纸滤过，滤液用氯仿定容至25 ml，制得供试品溶液。

　　2.2.4  线性关系考察精密吸取对照品溶液0，1，2 ，4 ，6，8 ml，分别置分液漏斗中，依次精密加入氯仿至10 ml，按供试品溶液的制备项下自“精密加入pH3.0醋酸盐缓冲液10 ml”起，至“滤液用氯仿定容至25 ml”，摇匀。照紫外分光光度法，分别在413nm的波长处测定吸收度。再以浓度为纵坐标，以吸收度为横坐标，绘制标准曲线C=0.515 3A-0.008 72（r=0.999 7）。结果表明乌头总生物碱在1.94～15.52 mg/ml间有良好的线性关系。结果见表3。

　　表3   线性关系考察结果（略）

　　2.2.5  精密度考察取浓度为0.155 2 mg/ml的对照品供试液，在413 nm的波长处，每次间隔约30 min，连续6次测定吸收度，计算其RSD＝0.53%。

　　2.2.6  重复性考察取去除被衬后的同一批号样品适量，精密称定5份，按供试品溶液的制备方法制得供试液。分别测定吸收度，测得总生物碱的平均含量为0.1053 mg/g，RSD=1.06%。

　　2.2.7  稳定性考察取去除被衬后的同一批号样品适量，精密称定5份，按供试品溶液的制备方法制得供试液。每间隔1 h，测定吸收度，连续考察7次，测得RSD＝0.33%（n＝7）。

　　2.2.8  加样回收率考察取去除被衬后的同一批号样品适量，精密称定5 g，计5份，精密转移入具塞锥形瓶，各精密加入浓度0.077 6 mg/ml的对照品溶液3 ml，放置10 min，用与“供试品溶液制备”项下相同方法制得供试液。按“样品含量测定”项下方法测定，并按下式计算加样回收率。结果见表4。
   
　　加样回收率（%）=［（测得量-原有量）/加入量］×100%

　　表4   加样回收率实验结果（略）

　　2.2.9  样品含量测定取3个批号的样品，去除被衬后，精密称定10 g，各3份，加10%的微粉硅胶，粉碎，精密转移入具塞锥形瓶，用与 “供试品溶液制备”项下相同方法制得供试液。采用“随行外标二点法”，求得随行标准曲线。将已制备供试品溶液于波长413 nm处，依次测定吸收度，从该标准曲线上读出浓度，计算，即得。结果见表5。

　　表5  样品的乌头类总生物碱含量测定结果（略）

　　3  结论
   
　　由以上实验结果可知，本文所用的改良异羟肟酸铁-高氯酸铁法及酸性染料比色法，精密度、重复性和加样回收率等均较好，符合定量要求。其中改良异羟肟酸铁-高氯酸铁法作为测定酯型生物碱含量的经典方法，收载于《中国药典》（2005版）Ⅰ部中［1］。
   
　　根据以上测定结果，暂定每克复方川乌止痛贴中含酯型生物碱以乌头碱计，平均含量为0.091 6 mg；复方川乌止痛贴中含总乌头碱以乌头碱计，平均含量为0.118 7 mg。

【参考文献】
  　　［1］ 国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］. 北京：化学工业出版社，2005：26.

　　［2］ 李云霞,孙 照,郭艳玲.酸性染料比色法测定川乌、草乌中总乌头生物碱的含量［J］.中成药,2000,22(9):662.