荠菜总黄酮多囊脂质体的制备和体外释放行为研究

作者：梁亦龙，戴传云，刘火安，舒坤贤

【摘要】 　　目的 研究了荠菜总黄酮多囊脂质体的制备和体外释放行为的研究。方法采用单因素实验，以芦丁为对照品，用吸光光度法测定荠菜总黄酮的含量，复乳法制备多囊脂质体，并对多囊脂质体的处方进行了筛选，同时，对荠菜总黄酮在不同释放介质中体外释放行为进行研究。结果药材比为1∶100，EPC∶TO∶Chol 的质量比为7∶2∶1和初乳与4.0 %的葡萄糖溶液的体积比为1∶2.5时，MVLs的包封率最优，对其体外释放行为研究发现，荠菜总黄酮在多囊脂质体中具有一定的缓释效应，并受释放介质pH的影响。结论荠菜总黄酮多囊脂质体具有一定的缓释效果。

【关键词】 荠菜总黄酮；多囊脂质体；释放性能

　　Abstract：ObjectiveTo prepare multivescular liposomes(MVLs) of total flavone in shepherd's-purse(TFS) with high encapsulation efficiency and sustained-release. MethodsSingle factor was utilized to optimize extracting process. Concentration of total flavone was measured by the spectrophotometer, with rutin as standard sample, MVLs was prepared by multiple emulsion methods under different condition. Release of the TFS from the liposomes was studied in vitro. ResultsRatio of drug and material used affected encapsulation efficiency of MVLs, the same as EPC∶TO∶Chol and first solution: 4% glucose. High encapsulation efficiency was gained, when the ratio was 1∶100, 7∶2∶1 and 1∶2.5, respectively. ConclusionThe total flavone in shepherd's-purse multivescular liposomes shows high encapsulation efficiency and sustained-release character.

　　Key words：Total flavone shepherd's-purse; Multivescular liposomes; Sustained-release

　　荠菜Capsella brusa-pastons L.属十字花科，也称春菜，一年生或三年生草本植物。荠菜总黄酮(Total Flavone in Shepherd's-purse, TFS)用来治疗高血压病，其功效比同为黄酮类的芦丁要好，且无毒性［1，2］。为了更好地利用荠菜的价值，将TFS长效制剂不失为一个极好的方法。脂质体作为一种靶向药物载体,具有类似细胞的结构,在体内可以改变被包封药物的体内分布,并具有缓释效果,从而减少药物的剂量和降低药物的毒性,提高药物的治疗指数。

　　多囊脂质体为脂质体多囊颗粒(Multivesicular Liposomes，MVLs)，这些囊泡被连续的非同心的类脂双分子磷脂膜所分离，具有更多的包封容积和较大的粒径，尤其当某个囊泡破裂时，药物只能从破裂的囊泡释出，完整的囊泡仍然可以保持原状，因而有很好的缓释效应［3］。

本文研究了TFS的非同心多囊脂质体制备方法,测定了包封率、粒径分布及体外释放性能等，以使其在体内服用后缓释作用,提高药物疗效，国内外尚未见TFS多囊脂质体的报道。

　　1 器材

UV-2100型分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；长风牌恒温水浴器（北京长风仪器仪表有限公司）；JA1003A电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；5810R冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；WH-2微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）；Waters-600型HPLC系统（美国Waters公司）；CJJ-1磁力搅拌器（常州国华电器有限公司）。

荠菜（采自重庆中药研究院苗圃）；芦丁标准品（中国医药集团上海化学试剂公司）；95%乙醇为分析纯，其他试剂均为化学纯；卵磷脂(EPC)（四川英格尔生物工程限公司）；三油酸甘油酯(TO)（北京金龙化学试剂有限公司）；（美国Sigma试剂公司）；胆固醇(Chol)（上海化学试剂公司）；其他试剂均为化学纯。

　　2 方法

　　2.1 TFS的提取［4,5］

　　称取刚摘取的荠菜样品10 g份于锥形瓶中，然后向瓶中各加入75%乙醇100 ml，再加入4%的NaOH醇溶液，于80℃恒温水浴中提取3次，将提取液合并浓缩，过预处理的AB-8大孔树脂，70%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，70℃水浴蒸干，得TFS。

　　2.2 含量的测定精密称取于120℃干燥后的无水芦丁20 mg，用75%乙醇溶解于100 ml容量瓶中，定容得浓度为0.2 mg/ml的标准液。分别精确称取上述标准液加水配制成0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.08，0.10 mg/ml芦丁溶液，在222 nm处分别测定吸收度，以吸光度对质量浓度进行线性回归。

　　2.3 MVLs的制备［6］

　　MVLs的制备采用复乳法(multiple emulsion method, MEM)，按配方将一定质量比的EPC，TO和Chol溶解于15 ml的有机溶剂(氯仿和乙醚)，搅拌使磷脂完全溶解，形成油相，缓慢滴加溶有TFS(浓度为1 mg/ml)的葡萄糖5.0%(W/V)溶液，旋涡振荡形成W/O型乳剂为“初乳”，取一定体积的“初乳”用注射器快速注入到含0.1%(V/V)的吐温-80乳化剂的4.0%(W/V)的葡萄糖溶液，旋涡振荡形成复乳，迅速将复乳转移到250 ml的圆底烧瓶中，充入N2，控制温度为35 ℃，旋转蒸发除去有机溶剂，既得MVLs悬浮液。

　　2.4 MVLs包封率的测定［7］

　　取制备的MVLs悬浮液1 ml，于Sephadex-50柱用Tris-HCl缓冲液洗脱，收集并测定游离的TFS含量，与标准曲线对应，计算TFS的含量和MVLs的包封率，包封率(Encapsulation efficiency，EE)的计算公式为：

EE(%)=M-mM×100%

　　其中 M：加入TFS的总质量

　　m：上清液中的TFS的质量。

　　2.5 MVLs处方与实验条件的筛选按上述MVLs的制备方法，分别以药材比(TFS与膜材的质量比，1∶200，1∶100 和3∶200) 、EPC∶TO∶Chol (质量比，8∶1∶1，7∶2∶1和6∶3∶1)和初乳与4.0 %的葡萄糖溶液的体积比(1∶1，1∶2.5，1∶4)为变量，以MVLs包封率为指标进行单因素考察实验。

　　2.6 释放介质的配制人工胃液 (Simulated Gastric Fluid，SGF，pH=1. 0的HCl溶液)：精确量取9.0 ml浓盐酸于适量蒸馏水中，转至1 000 ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度线。人工肠液 (Simulated Intestinal Fluid，SIF，pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液)：精确称取NaCl 1.600 g和KH2PO4 6.800 g，用适量蒸馏水溶解，转至1000 ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度线。

生理溶液 (Simulated Body Fluid，SBF，0.9%的NaCl溶液)：精确称取NaCl 9.000 g，于烧杯中用适量蒸馏水溶解，转移至1 000 ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度线。

　　3 结果与讨论

　　3.1 芦丁的标准曲线质量浓度分别为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.08，0.10 mg/ml的芦丁标准液用分光光度计法检测，以吸光度对芦丁的质量浓度进行线性回归，结果如图1所示，相关系数r=0.999 9，表明在0.01～0.10 mg/ml有良好的线性关系。

　　3.2 各因素对MVLs包封率的影响

　　3.2.1 药材比在MVLs的制备过程中，当其它条件不变时，改变TFS与膜材的质量比，复乳法制备，分离出MVLs并测定MVLs的包封率，结果如图2所示，由图2可看出，随着包封药物所占比例的增大，MVLs的包封率也不断增大，当药材比为1∶100时，MVLs的包封率为33.06%，3∶200时，MVLs的包封率增大为35.14%，但总体趋势来看，随着包封药物所占比例的增大，包封率变化趋势不明显，综合考虑，TFS与膜材的质量比为1∶100时最合适。

　　3.2.2 磷脂比在MVLs的制备过程中，当其它条件不变时，改变EPC∶TO的质量比，复乳法制备，分离出MVLs并测定MVLs的包封率，结果如图3所示，由图3可看出，随着TO的比例增大，TFS在MVLs的包封率先增大，然后减少，当EPC∶TO∶Chol为7∶2∶1时，TFS在MVLs的包封率最高，为36.55%，因此，EPC∶TO∶Chol为7∶2∶1是最佳比例。

　　3.2.3 初乳与4.0 %的葡萄糖溶液的体积比在MVLs的制备过程中，当其它条件不变时，改变初乳与4.0 %的葡萄糖溶液的体积比，采用复乳法制备，分离出MVLs并测定MVLs的包封率，结果如图4所示，由图4可看出，MVLs的包封率先升后降，初乳与4.0 %的葡萄糖的体积比为1∶2.5时，TFS在MVLs的包封率最高。因此，初乳与4.0 %的葡萄糖的体积比为1∶2.5为最佳比例。

　　3.3 TFS不同介质中的释放行为图5为TFS在不同的释放介质中的释放行为，结果表明，TFS在MVLs中具有一定的缓释效应，pH值不同，释放速率不同，TFS在pH=1.0的SGF溶液中的释放速率最慢， pH分别为7.0，7.4的SBF和SIF释放介质中速率次之。说明TFS在MVLs中的释放行为受pH值的影响。

　　4 结论

实验表明：MVLs的制备采用复乳法，质量比为EPC∶TO∶Chol=7∶2∶1的膜材，溶解于15 ml的有机溶剂中，搅拌使磷脂完全溶解，形成油相，缓慢滴加溶有TFS(浓度为1 mg/ml)的葡萄糖5.0%(W/V)溶液，旋涡振荡形成W/O型乳剂为“初乳”，取的“初乳”用注射器快速注入到2.5倍体积的含0.1%(V/V)的吐温-80乳化剂的4.0%(W/V)的葡萄糖溶液，旋涡振荡形成复乳，迅速将复乳转移到250 ml的平底锥形瓶中，置于旋转蒸发仪上，用氮气吹除有机溶剂，既得的MVLs包封率最佳。对其体外释放行为研究发现，TFS在MVLs中具有一定的缓释效应，并受释放介质pH的影响。

【参考文献】
　　［1］卢 胜,苏浓,王桂泽.营养保健型佳蔬——荠菜［J］.中国食物与营养, 2004(7): 53.

　　［2］程爱芳.荠菜的营养价值及药用价值［J］. 蔬菜, 2004(6):36.

　　［3］肖超菊,齐宪荣,艾尼瓦尔,等. 顺铂缓释多囊脂质体的制备和体外释放性能研究［J］. 药学学报, 2003, 38(2): 133.

　　［4］刘火安, 戴传云, 王伯初. 荠菜总黄酮的分离纯化研究［J］. 时珍国医国药, 2006, 17(7): 1161.

　　［5］梁亦龙，戴传云，李 标，等. 荠菜总黄酮提取工艺的研究［J］.食品研究与开发, 2006, 27(5): 73.

　　［6］Kim S, Turker MS, Chi EY, et al. Preparation of multivesicular liposomes［J］. Biochim Biophys Acta, 1983, 728(3): 339.

　　［7］张俊红, 朱家璧, 王 虹. 阿米卡星脂质体包封率测定［J］. 中国药学杂志, 1999, 34(12): 818.