丹参酮ⅡA对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用及机制

【摘要】  　　目的探讨丹参酮ⅡA（Tan ⅡA）对缺血再灌注损伤大鼠保护作用及对额顶部皮质中性粒细胞浸润、自由基含量、能量代谢的影响。方法将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、Tan ⅡA低剂量治疗组和Tan ⅡA高剂量治疗组，线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型。Tan ⅡA高、低剂量治疗组于术前连续灌胃给药3 d，1次/d。用生化法观察缺血90 min再灌注24 h大鼠额顶部皮质髓过氧化物酶（MPO）活性、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛（MDA）含量、三磷酸腺苷（ATP）含量及脑含水量变化，并进行2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）染色检测脑梗塞体积。结果Tan ⅡA治疗组脑梗塞体积较缺血再灌注组减小，高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P<0.05）；与缺血再灌注组比较，Tan ⅡA治疗组显著降低MPO活性、MDA含量，增加SOD 、ATP含量，降低脑组织含水量，高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P<0.05）。结论Tan ⅡA对缺血再灌注脑损伤具有保护作用，其机制可能与减轻缺血再灌注损伤炎症反应，减轻氧化性损伤和改善能量代谢有关。

【关键词】  缺血再灌注； 髓过氧化物酶； 自由基； 三磷酸腺苷； 丹参酮Ⅱ

　　Abstract：ObjectiveTo study the effect of Tanshinone ⅡA (Tan ⅡA)  on neutrophils infiltration and the contents of free radical and ATP in ischemic frontal and parietal cortex of cerebral ischemia reperfusion（I/R） rats.MethodsIn this experiment, rats were randomly pided into 4 groups, namely sham operated group, I/R group,low dose Tan ⅡA treated group and high  dose Tan ⅡA treated group. The focal middle cerebral artery occlusion(MCAO) model was made by suture-occluded method.Rats were pretreated with Tan ⅡA ig for 3d,respectively. After 90min MCAO following 24h of reperfusion, the MPO activity, the contents of SOD and MDA in ischemic frontal and parietal cortex were investigated. TTC staining was used to calculate the cerebral infarct volume.ResultsCompared with I/R group,cerebral infarction volume in low dose Tan ⅡA treated group and high  dose Tan ⅡA treated group decreased in a dose-dependent manner (all P<0.05). Compared with I/R group, low and high dose Tan ⅡA treated groups dose-dependently reduced MPO activity,the content of MDA and brain water content, increased the activity of SOD and the content of ATP. ConclusionTan ⅡA may  aueviate cerebral ischemia-reperfusion injury by decreasing the inflammation reaction , free radicals and the disbanlance of energy metabolism.

　　Key words：Ischemia-reperfusion; Myeloperoxidase; Free radical; ATP；Tanshinone ⅡA

    丹参Salvia miltorrhiza Bge为唇形科多年生草本植物，是我国传统具有活血化淤作用的中药，已被广泛用于心脑血管疾病的治疗，但其作用机制尚不十分清楚。丹参酮( Tanshinone)是丹参的有效活性组分，其中丹参酮ⅡA（Tanshinone ⅡA，Tan ⅡA） 为丹参酮中含量最高的活性成分。本实验采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，研究丹参酮ⅡA对大鼠脑缺血再灌注损伤缺血区额顶部皮质中性粒细胞浸润、自由基含量、能量代谢、脑组织含水量及梗塞体积变化的影响，探讨其对脑再灌注损伤保护作用机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  药品与试剂 

　　Tan ⅡA由提供上海第一生化药业有限公司提供，纯度85％。髓过氧化物酶（MPO），丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。TTC购自中国医药集团上海化学试剂公司。

　　1.2  动物分组及给药方法

　　健康Wistar大鼠，雄性，清洁级，共100只，质量（250±30）g（广西医科大学动物实验中心提供）。按随机分组原则分成假手术组（25只）、缺血再灌注组（25只）、Tan ⅡA低剂量治疗组（25只）及Tan ⅡA高剂量治疗组（25只）。Tan低剂量治疗组（15 mg/kg）和高剂量治疗组（30 mg/kg）均于术前连续灌胃给药3 d，1次/d，假手术组和缺血再灌注组给予等量的生理盐水灌胃。第3天给药后1 h建立缺血90 min再灌注24h动物模型。

　　1.3  动物模型的建立

　　参照Longa等［1］的方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。采用颈外动脉插入线栓法，各组均进行左侧大脑中动脉栓塞。线栓采用石蜡线栓。线栓直径约0.27 mm，插入深度约18 mm，此时线栓头位于大脑中动脉起始部。缺血90 min时，抽提线栓实现再灌注。神经功能缺陷评分：按照 Longa等［1］评分标准，各组分别在再灌注24 h进行评分。0分：正常，无神经学征象；1分：动物不能完全神展右前肢；2分：动物右侧肢体瘫痪，行走时向右侧转圈，出现追尾现象；3分：动物行走向右侧跌倒，或动物不能站立或动物打滚；4分：无自发活动，有意识障碍。神经功能缺陷评分在1～3分为模型成功。

　　1.4 MPO活性的测定 

　　再灌注24h，将大鼠开颅取脑，置于4℃冰箱5 min，在冰浴下取左侧距离嗅球尖端7～11 mm之间的额顶部皮质，以试剂盒提供的匀浆介质制成脑组织匀浆。严格按试剂盒说明书步骤要求操作，计算出MPO活力单位。

　　1.5 MDA和SOD的测定

　　再灌注24h，将大鼠开颅取脑，置于4℃冰箱5 min，在冰浴下取左侧距离嗅球尖端7～11 mm之间的额顶部皮质，以试剂盒提供的匀浆介质制成脑组织匀浆（步骤和方法同上）。严格按试剂盒说明书步骤要求操作，计算出MDA和SOD含量。

　　1.6  三磷酸腺苷（ATP）含量测定

　　再灌注24 h，将大鼠开颅取脑，置于4℃冰箱5 min，在冰浴下取左侧距离嗅球尖端7～11 mm之间的额顶部皮质，迅速加入乙腈，混匀，冰浴离心脱蛋白，离心后取上清液水系滤膜过滤后，-86℃保存。用高效液相测定ATP含量。

　　1.7  脑含水量检测

　　再灌注24 h，各组随机取5只大鼠，断头取脑后，快速称取左右大脑半球湿重，置110～115℃烤箱内烤至恒重，再分别称其干重，用(湿重- 干重) /湿重的百分比，作为衡量脑含水量指标。

　　1.8 TTC染色

　　再灌注24h，将各组另外5只大鼠深麻后开颅取脑。将鼠脑置于－4℃冰箱20min后，将其切成5等份冠状位切片，置于2％TTC溶液中，水浴、多聚甲醛液固定。用计算机病理图像分析仪及梯形法计算出梗塞灶体积，各脑片梗死灶体积之和即为梗塞体积。左侧大脑半球梗死灶区呈白色，主要为额顶部皮质和尾壳核，正常组织呈红色。部分组织表现为由白色向红色过度区。

　　1.9 统计学方法
 
　　数据处理采用SPSS11.5统计软件进行运算，结果以±s表示，组间差异显著性检验采用方差分析。　2  结果

　　2.1 TAN ⅡA对MPO活性的影响

　　结果见表1。假手术组MPO活性呈低水平。缺血再灌注组缺血侧MPO活性较假手术组明显升高（P<0.05）；TAN ⅡA高、低剂量治疗组MPO活性较缺血再灌注组明显降低（均P<0.05）；高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P<0.05）。表1  TAN ⅡA对MPO，MDA， SOD，ATP含量，脑含水量及脑梗塞体积影响（略）

　　2.2 Tan ⅡA对MDA、SOD含量的影响

　　缺血再灌注组缺血侧额顶部皮质SOD含量下降，MDA含量升高，与假手术组比较，差异具有显著性（P<0.05）。Tan ⅡA治疗组可提高额顶部皮质SOD含量，降低MDA含量，与缺血再灌注组相比较，差异具有显著性（P<0.05）；高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P<0.05）。见表1。

　　2.3  Tan ⅡA对ATP含量的影响 

　　缺血再灌注组缺血侧额顶部皮质ATP含量下降，与假手术组比较，差异具有显著性（P<0.05）；Tan ⅡA治疗组ATP含量升高，与缺血再灌注组相比较，差异具有显著性（P<0.05），高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P<0.05）。见表1。

　　2. 4 Tan ⅡA对脑水肿的影响 

　　缺血再灌注组缺血侧脑组织含水量较假手术组明显升高，差异具有显著性（P<0.05）； Tan ⅡA治疗组降低脑组织含水量，与缺血再灌注组相比差异有显著性(P<0.05) ，高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P<0.05）。见表1。

　　2.5 Tan ⅡA对脑梗塞体积的影响 

　　TTC染色后，缺血再灌注24h左侧大脑半球梗塞灶区呈白色，主要为额顶部皮质和尾壳核，正常组织呈红色。部分组织表现为由白色向红色过度区。TTC染色形态学观察显示，用石蜡线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，可使大脑中动脉供血区出现恒定的、复制性良好的梗塞灶（图1）。 Tan ⅡA高、低剂量组梗死体积较缺血再灌注组显著减小（P<0.05）；高、低剂量组之间差异亦具有显著性（P<0.05）。

　　3 讨论

    何丽娜等［2］研究发现，丹参酮对原代大鼠神经细胞缺血性损伤有保护作用。本研究结果也证实，脑缺血再灌注损伤给予Tan ⅡA治疗，可明显减少减轻再灌注损伤脑水肿及梗塞体积，对缺血脑组织有保护作用，高剂量GBE的保护效果更显著。
   
　　MPO主要存在于中性粒细胞的噬天青颗粒中。MPO活性反映中性粒细胞在脑组织中浸润程度。我们前期研究已证实，脑缺血再灌注损伤出现了中性粒细胞参与为标志的炎症反应过程，减轻脑缺血再灌注损伤后炎症反应对缺血脑组织有保护作用［3］。本研究结果提示，脑缺血再灌注损伤给予Tan ⅡA腹腔注射治疗，可明显减少缺血再灌注后MPO活性，减少中性粒细胞的浸润，对缺血再灌注损伤炎症反应有抑制作用。胡霞敏等［4］预防性用药给予缺血再灌注损伤大鼠Tan ⅡA治疗，发现Tan ⅡA对缺血再灌注损伤炎症反应也有抑制作用，与我们的实验结果相一致。
   
　　缺血性脑卒中损伤机制中自由基连锁反应是重要一环。当脑缺血特别是再灌注期，自由基生成和代谢的动态平衡被打破，氧化应激反应发生，活性氧簇生成增多，引起脂质过氧化反应，形成脂质过氧化物如MDA等，最终导致膜结构的完整性遭到破坏，细胞内环境紊乱；同时，自由基诱导DNA、RNA、蛋白质交联，生物活性大分子断裂、解聚；线粒体变性，细胞凋亡或坏死。同时，当脑缺血发生时， 脑组织供血不足，能量合成物质供应缺乏，细胞能量代谢发生障碍，细胞内ATP水平下降， Na＋,K+-ATP酶活性降低，大量Na+内流，K+外流，细胞去极化，细胞内游离Ca2＋浓度升高，导致了自由基的生成远远超过了机体的清除能力，造成自由基堆积，形成恶性循环，加重脑损伤。SOD则能够清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，其活性间接反映了机体清除自由基的能力。我们的实验发现，Tan ⅡA可显著降低缺血侧脑组织中MDA的含量，提高脑组织SOD活性和ATP水平，提示Tan ⅡA能降低氧化应激程度，减少体内自由基的形成，增加机体清除自由基的能力，并能改善能量代谢障碍，可能与Tan ⅡA抑制急性脑缺血细胞钙超载有关［5］。
  
　　综上所述，Tan ⅡA对缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制可能与减少缺血再灌注后炎症反应，减轻氧化性损伤和改善能量代谢障碍有关，高剂量Tan ⅡA的保护效果更显著。

【参考文献】
  　　［1］Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al. Reversible middle cerebral artery occusion without cranietomy in rats［J］. Stroke,1989,20(1): 84.

　　［2］何丽娜,何素冰,杨 军,等.丹参酮对原代大鼠神经细胞缺血性损伤的保护作用［J］.中国药理学通报,2001,17(2):214.

　　［3］李浩,毕桂南,罗传铭,等.鼠脑缺血再灌注损伤炎症反应及环磷酰胺影响［J］.中风与神经疾病杂志,2006,23(5):541.

　　［4］胡霞敏,周密妹,胡先敏,等.丹参酮ⅡA对脑缺血再灌注大鼠脑损伤的保护作用及对能量代谢的影响［J］.中国临床药学杂志,2006,15(3):176.

　　［5］卢振和,郑志远,黄文起,等.丹参酮ⅡA联合硫酸镁对兔脑急性缺血后钙超载的影响［J］.临床麻醉学杂志,2006,22 (1):46.