血清芽管实验检测白假丝酵母菌的药物敏感性

【摘要】  目的了解泌尿生殖道感染白假丝酵母菌对黄连、黄芩、七叶一枝花和氟康唑注射液的敏感性，为临床有效控制其感染提供依据。方法采用白假丝酵母菌芽管药敏试验法，测定黄连、黄芩、七叶一枝花的50%乙醇提取物和氟康唑注射液对从泌尿生殖道感染标本中分离出的52株白假丝酵母菌芽管的最低抑制浓度。结果黄连、黄芩、七叶一枝花的50%乙醇提取物和氟康唑注射液，在一定的浓度下对泌尿生殖道感染白假丝酵母菌芽管有明显的抑制作用，其抑制芽管的最低浓度分别为1.25，5，2.5 mg/ml和0.125 mg/ml。结论 白假丝酵母菌芽管药敏试验法，可为临床快速筛选敏感药物；黄连、黄芩、七叶一枝花的50%乙醇提取物和氟康唑注射液对白假丝酵母菌有较好的抗菌活性。

【关键词】  血清芽管试验 白假丝酵母菌 黄连 黄芩 七叶一枝花 氟康唑注射液 药物敏感性 抗菌活性

白假丝酵母菌（Candida albicans）又称白色念珠菌，是常见的条件致病性真菌，其既可引起皮肤粘膜的感染，又可致内脏器官及中枢神经的感染［1］。近年来，随着广谱抗生素、皮质类固醇激素和免疫抑制剂的被广泛应用，白假丝酵母菌感染呈上长趋势，并已跃居深部真菌感染的首位［2］。且耐药菌株逐年增加，给临床治疗带来极大困难。为了能及时向临床提供敏感药物，治疗白假丝酵母菌感染并减少耐药菌株的产生和播散，我们参照唐书谦等［3］推荐的白念珠菌芽管法药敏试验新方法，用黄连、黄芩、七叶一枝花的50%乙醇提取物和氟康唑注射液对白假丝酵母菌进行药物敏感性试验。现将结果报告如下：

    1  材料与方法

    1.1  菌株  52株白假丝酵母菌分离自赣南医学院第一附属医院门诊送检的119例泌尿生殖道感染患者。

    1.2  药物来源  黄连、黄芩、七叶一枝花由赣南医学院第一附属医院中药房提供。氟康唑注射液：2mg /ml，广东太阳神集团荔城制药厂，批号03061311）。

    1.3   药物提取方法  取黄连、黄芩、七叶一枝花各200 mg，分别加适量50%乙醇浸泡12 h，然后80°C水浴箱中热浸4 h，滤去药渣，滤液用文火浓缩至10 ml，制成浓度为20 mg/ml的药液备用。

    1.4  实验方法

    1.4.1  试验管 氟康唑注射液和黄连、黄芩、七叶一枝花提取物分别用生理盐水倍比稀释6次，氟康唑注射液浓度为2～0.031 25 mg/ml，黄连、黄芩、七叶一枝花提取物浓度为20～0.312 5 mg/ml。再分别取7种药物稀释液各0.5 ml加入盛有0.5 ml新鲜兔血清的试管中，混匀。

    1.4.2  对照管  0.5 ml生理盐水加0.5 ml新鲜兔血清混匀。

    1.4.3  菌液接种  以上各管分别接种5×107CFU/ml白假丝酵母菌20 μl混匀，置37°C温箱内孵育3 h后取出观察。

    1.5  结果判断

    1.5.1  镜检芽管数与芽管生长的长度  将芽管数、芽管生长的长度与对照管比较，一般超过菌体直径2倍以上，为正常生长芽管。芽管长度小于或等于菌体直径者，为受抑制芽管。

    1.5.2  芽管计数  按白细胞计数法，分别计算出以上4种药物7种不同稀释浓度出现的正常芽管和受抑制芽管的数量。

    1.5.3  药物敏感性判断  无芽管生长者为敏感；有芽管生长，若受抑制芽管在100%以上者，为中度敏感；若受抑制芽管在50%左右者为轻度敏感；若与对照芽管长度基本一致者为不敏感。2  结果

    2.1  不同药物抑制芽管试验的敏感性比较结果见表1～4。结果表明黄连、黄芩、七叶一枝花50%乙醇提取物和氟康唑注射液，在一定的浓度下对泌尿生殖道感染白假丝酵母菌芽管有明显的抑制作用，其抑制芽管的最低浓度分别为1.25，5，2.5 mg /ml和0.125 mg /ml。

    2.2  对照试验　芽管生长正常，一般超过菌体直径2倍以上。表1  氟康唑注射液对52株白假丝酵母菌的抗菌活性 氟康唑注射液 表2  黄连对52株白假丝酵母菌的抗菌活性表3  黄芩对52株白假丝酵母菌的抗菌活性黄芩浓度 表4  七叶一枝花对52株白假丝酵母菌的抗菌活性七叶一枝花浓度

    3   讨论

    随着系统性真菌感染及耐药菌株的不断增多，借助药敏试验进行抗真菌药物的选择越来越被人们所关注［4］。本实验采用唐书谦等［3］推荐的白念珠菌芽管法药敏试验新方法，将一定浓度的黄连、黄芩、七叶一枝花的50%乙醇提取物和氟康唑注射液与血清混合，再接种一定量的菌液，置37℃温箱内孵育2～3 h，观察白假丝酵母菌芽管的生长情况，最终评估该药对白假丝酵母菌芽管的抑制程度。该法与琼脂扩散法相比，可缩短孵育时间(因常规白假丝酵母菌37℃孵育需48 h，现只需孵育2～3  h)，能快速筛选出对白假丝酵母菌有效的药物，这对泌尿生殖道白假丝酵母菌感染患者能及时得到有效治疗具有重要的临床价值。

    本实验结果表明不同菌株的白假丝酵母菌对药物的敏感性存在差异。从表1可看出，氟康唑注射液抑制芽管的最低浓度为0.125 mg/ml。由于该药能特异、有效地抑制真菌的甾醇合成，可在全身组织广泛分布，半衰期较长，约为35.4 h，每日仅需用药1次，且耐药率较低，是目前医院治疗真菌感染的常用药物。

    3种常用中草药对白假丝酵母菌芽管试验中，以黄连效果最好，其次为七叶一枝花，第三为黄芩，它们抑制芽管的最低浓度分别为1.25 ，2.5和5 mg/ml，与马廉兰等［5］报道采用琼脂扩散法所测的最低抑菌浓度有差异，但本文所测抑制芽管的最低浓度与马廉兰等报道的最低抑菌浓度成正相关。

    白假丝酵母菌以出芽繁殖，其结构复杂，细胞壁的主要成分为多糖，在酵母相以葡聚糖为主，在菌丝相以几丁质为主，几丁质在酵母相中主要位于母细胞的芽痕处，是组成母子细胞间隙的主要成分，也是酵母菌出芽时的必要成分，酵母相转化为菌丝相时几丁质的合成增加3～4倍［6］。因此推测出芽抑制机理是否为药物作用白假丝酵母菌的某些细胞壁合成酶(如几丁质合成酶)，有待进一步探讨。

【参考文献】
  ［1］ 陆德源.医学微生物学，第5版［M］.北京：人民卫生出版社，2001：237.

［2］ Cardenas-Freytag L,Cheng E,Mayeux P,et al.Effect-iveness of a vaccine composed of heat-killed Candida albicans and a novel mucosal adjuvant,LT(R192G),against systemic candidiasis［J］.Infect Immun.1999,67(2) ：826.

［3］ 唐书谦，廖 军，钟白玉，等.白念珠菌芽管法药敏试验新方法［J］.第三军医大学学报，2003,25(9):825.

［4］ National committee for clinical laboratory standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast;Approved Standard M27-A［J］.Lancaster Avenue,Villanova.Pennsylvania:NCCLS,1997：1.

［5］ 马廉兰，钟有添.六种中草药对深部感染真菌的体外抑菌效果［J］.赣南医学院学报，2001,21(3):1.

［6］ 闻玉梅.现代医学微生物学［M］.上海：上海医科大学出版社，1999：678.