中药对乳酸杆菌与解脲脲原体临床分离株的体外抑制实验研究

【摘要】  目的测定7味中药对解脲脲原体（Uu）临床分离株及乳酸杆菌的影响。方法用微量稀释法测定柴胡、蛇床子、苦参、黄连、槐花、野菊花、夏枯草对Uu临床株的最小抑菌浓度（MIC值）以及体外抑制乳酸杆菌的抑菌圈直径。结果黄连、夏枯草对Uu较高敏感，MIC90均为7.81 mg/ml；蛇床子、槐花、野菊花中度敏感，MIC90为31.25～62.5 mg/ml；柴胡、苦参不敏感。黄连对乳酸杆菌的抑菌圈直径为8 mm，其它中药均为0 mm。红霉素对Uu敏感率为29.41%，对乳酸杆菌抑菌圈直径为22 mm。结论7味中药体外对Uu有不同程度的抑制作用，对乳酸杆菌无影响。红霉素体外对Uu及乳酸杆菌均有抑制作用。

【关键词】  解脲脲原体; 乳酸杆菌； 中药； 最小抑菌浓度

解脲脲原体（Ureaplasma urealyticm, Uu）是泌尿生殖道感染的常见病原体之一，它不仅引起非淋球菌性尿道炎，还可引起泌尿生殖道多种疾病，如阴道炎、宫颈炎、盆腔炎、不孕不育等。目前西药治疗首选四环素类、喹诺酮类及大环内酯类，但随着耐药株的增加，加之强效广谱抗菌素反复应用引起的副作用、菌群失调等，使本病治疗面临重重困难。本实验在原有的基础上，探讨中药体外对Uu与乳酸杆菌的作用，旨在为治疗Uu感染找到更好的药物。

　　1  材料与仪器

　　1.1  菌株来源17株Uu临床分离株及干酪乳杆菌干酪亚种均来源于同济医院性病研究中心实验室。

　　1.2  药物中草药：柴胡、蛇床子、苦参、黄连、槐花、野菊花、夏枯草水煎剂1g/ml（即每毫升相当于1 g生药），由上海市中医医院制剂室制备。西药：红霉素批号050601(上海先锋药业有限公司)，由同济医院性病研究中心实验室制备。

　　1.3  仪器及试剂工作净化台（TDGC2j-0.5和TDGC2j-1/0.5）、手提式压力蒸气灭菌器（YXQ.SG41.280）、CO2培养箱（SHEL LRB2300）、液氮生物容器、显微镜（CH30RF200）、Uu液体培养基、96孔细胞培养板等。

　　2  方法

　　2.1  中草药煎剂制备方法分别称取柴胡、黄连、夏枯草等7味药材，加入500 ml水，浸泡1 h，电炉煎煮，沸后30 min，过滤，沉渣加水煎煮，再过滤，两液混合，浓缩至1∶1，离心取上清液，调整pH值至（6.0±0.5），高压灭菌10 min，备用。

　　2.2  乳酸杆菌培养基制备方法参照凌代文［1］《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》。

　　2.3  最小抑菌浓度（MIC值）测定方法微量稀释法测定中草药煎剂的MIC值：Uu培养及其CCU（颜色改变单位）测定按文献（Robertson JA,1982）方法［2］，中草药煎剂的MIC测定按文献(Kenny GE,1986)方法略加改进。

　　2.3.1  菌液准备将Uu株复苏后，传代3次，取第3代对数生长期（106CCU/ml），稀释20倍作为工作菌液。

　　2.3.2  加Uu液体培养基在96孔 (8×12)板上第1孔加培养基150 μl,第12孔加200 μl,第2～11孔各加100 μl。

　　2.3.3  加药物第1，2行第1孔各加药物50 μl。

　　2.3.4  倍比稀释药物从第1孔开始，用微量移液器吹打混匀，吸出100 μl至下一孔，再混匀，依次类推，直至第10孔。这样药物浓度从第1～10孔依次为250 mg/ml、125 mg/ml、……，共10个浓度。

　　2.3.5  加Uu菌液第1～11孔各加100 μl。第11孔为阳性对照，第12孔为阴性对照。

　　2.3.6  MIC值的判定将培养板盖上板盖，置于37℃恒温培养箱中孵育。当第11孔阳性对照孔明显生长（孔内颜色由黄色变为红色）时，开始判读结果，以不出现颜色变化（无Uu生长）孔的最小药物浓度为抗Uu的MIC值。

　　2.4  抑菌圈直径测定方法琼脂倾注法测定抑菌圈直径，方法如下。

　　2.4.1  菌液准备将乳酸杆菌菌液连续传代3次，加入无菌生理盐水比浊到1.5×108/ml，作为工作菌液。

　　2.4.2  加菌液取1 ml工作菌液，平铺于圆形平皿上。

　　2.4.3  加培养基将琼脂培养基熔化后，倾注于圆形平皿中轻摇混匀。

　　2.4.4  打孔待琼脂培养基凝集后，用打孔器在上面打孔，中间1孔，周边6孔。

　　2.4.5  加药物中间孔加入红霉素50 μl，周边孔加入不同浓度的中药水煎剂50 μl。

　　2.4.6  测量抑菌圈的直径培养18 h后观察，如药物无抑菌作用，则孔周围长满乳酸杆菌，如有抑菌作用，则孔周围无乳酸杆菌生长，形成抑菌圈，测量抑菌圈的直径。

　　2.5  统计学分析所有实验数据均采用SPSS13.0软件进行统计学分析，本实验为计量资料，采用方差分析及组间比较法。3  结果

　　3.1  7味中草药与红霉素体外抗Uu的结果见表1。

　　表1  7味中草药与红霉素对17株Uu临床分离株的MIC值（略）

　　中草药对病原菌的MIC值，目前国内外尚无统一标准，参照文献［3］国内同类实验的标准为判断依据，以MIC90为依据，黄连与夏枯草对Uu为较高敏感，蛇床子、槐花、野菊花为中度敏感，柴胡、苦参不敏感。

　　表2  红霉素对17株Uu临床分离株体外抑制作用结果（略）

　　“－”表示无抑制Uu株
     
　　根据曹玉璞主编《支原体与支原体病》红霉素抗Uu的MIC值≤1 μg/ml时为敏感，本实验17株中，5株敏感，其敏感率为29.41%。参照美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）1995年制订的标准，根据红霉素耐药标准（即MIC≥16 μg/ml），判定为耐药临床株［4］，本次实验有两株为红霉素耐药株。

　　3.2  7味中草药与红霉素体外抗乳酸杆菌的结果柴胡、蛇床子、槐花、苦参、夏枯草、野菊花随着药物浓度的增大对乳酸杆菌的抑菌圈直径均为0 mm。黄连在药物浓度比较小时对乳酸杆菌的抑菌圈直径为0 mm，当药物浓度增大到125 mg/ml时，出现抑菌圈，直径为8 mm。
   
　　红霉素体外抑制乳酸杆菌的抑菌圈直径见表3。

　　表3  红霉素体外抑制乳酸杆菌的抑菌圈直径（略）

　　参照凌代文主编《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》中常见抗菌素对革兰氏阳性菌标准菌株抑菌圈直径的标准［1］，本实验红霉素在15 μg含量时，抑菌圈直径为22 mm，判断红霉素对乳酸杆菌中度敏感。

　　4  结论
   
　　7味中药体外对Uu有不同程度的抑制作用，对乳酸杆菌无影响。红霉素体外对Uu及乳酸杆菌均有抑制作用。

　　5  分析与讨论
   
　　Uu感染在中医古典医籍中没有明确记载，它所引起的女性生殖系统疾病属于中医“带下”“阴痒”等范畴。隋·巢元方［5］《诸病源候论》中记载：“妇人阴痒，是虫蚀所为。三虫九虫在肠胃之间，因脏虚虫动作，食于阴，其虫作势，微则痒，重者乃痛。”可见古人虽分不出支原体、滴虫、霉菌等病原体，但已认识到阴痒是虫蚀所为。
   
　　Uu是泌尿生殖道感染的常见病原体之一，它不仅引起非淋球菌性尿道炎，还可引起泌尿生殖道多种疾病。目前，Uu的致病机制尚不清楚，可能与多种因素有关，如宿主的抵抗力、菌群失调、Uu血清型别等。正常情况下，Uu寄生在人泌尿生殖道粘膜上，并不致病，当阴道酸性环境遭到破坏，局部抵抗力下降时，即成为条件致病菌，导致生殖系统炎症的发生。有资料［6］报道，乳酸杆菌作为正常菌占阴道所有微生物的95%，而阴道炎患者，乳酸杆菌仅占25%～55%。Dominguez等［7］在实验研究中发现Uu在乳酸杆菌缺乏时更常见。
   
　　本次实验结果发现，黄连虽对乳酸杆菌有一定的影响，但对Uu也有较高敏感作用，是否与它药配伍能增强黄连抗Uu作用，削弱对乳酸杆菌的影响，值得我们进一步研究。夏枯草对Uu较高敏感，蛇床子、槐花、野菊花对Uu中度敏感，并且它们对乳酸杆菌的抑菌圈直径为0 mm，说明它们不仅能抑制Uu而且对乳酸杆菌无影响，为临床治疗Uu感染的较好药物。柴胡、苦参体外对Uu不敏感，但对乳酸杆菌亦无影响，是否因为对乳酸杆菌无影响，保持阴道正常的酸碱度，对Uu起到间接的抑制作用，还需深入研究。以上结果证明中药不仅有抑制Uu的作用,而且能维持阴道内正常的乳酸杆菌。分析原因可能为：①中药对乳酸杆菌无抑制作用，乳酸杆菌分解阴道粘膜上皮中贮存的糖元产生乳酸，维持阴道的正常酸性环境。而Uu最适宜在pH为6.0～6.5的环境中生长，中药通过维持阴道的正常酸性环境，从而破坏Uu的生存环境，对Uu起到很好的抑制作用。②正常情况下，阴道内的乳酸杆菌有序牢固地黏附于阴道粘膜上皮，形成空间性的占位保护作用。中药对这些乳酸杆菌没有影响，维持了其在阴道上皮的定植抗力，从而阻止外来Uu的入侵。③中药本身含有抑制Uu的有效成分，加上不影响乳酸杆菌，起到扶正祛邪的作用。④中药不抑制乳酸杆菌，乳酸杆菌大量定植于阴道中，其营养处于竞争优势状态，则Uu无足够的营养供应，不利于生长。并且乳酸杆菌能产生多种抗微生物因子，有效地抑制其它细菌的生长繁殖，调整着阴道的菌群失调，对Uu也起到很好的抑制作用。
   
　　实验中还发现，西药红霉素体外抑制Uu的同时，对乳酸杆菌也有抑制作用。因此，长期使用抗生素会导致乳酸杆菌数量的减少，使阴道内pH值发生改变，更重要的是乳酸杆菌数量减少，其产生的过氧化氢和抗微生物因子亦减少，失去对阴道内一些寄生菌（包括Uu）生长的抑制作用。这可能正是临床上使用抗生素治疗，Uu阳性患者顽固复发的一个重要原因。

【参考文献】
  ［1］ 凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法,第1版［M］．北京：中国轻工业出版社,1998：86.

　　［2］ Roberson JA,Stemke GW.Expanded serotyping scheme for Ureaplasma urealyticum strains isolated from humans［J］.J Clin Micrlbiol, 1982,15:812.

　　［3］ 刘忠仪，张国威，何云志.解脲支原体中药药敏试验［J］.中华皮肤科杂志,1996,29(5)：349.

　　［4］ 陆 原，陈迟灿，李鸣九，等.尿路清对Uu国际标准株临床耐药株的抑菌实验研究［J］.中医药学刊,2002,20(1)：49.

　　［5］ 张玉珍.中医妇科学,第1版［M］.北京：中国中医药出版社,2002：328.

　　［6］ 杨景云．医学微生态学,第1版［M］．北京：中国医药科技出版社，1997:192.

　　［7］ Dominguez D.Tavira LT.Duane.A.et al.Ureaplasma urealyticum biovar determination in women attending a family planning clinc in Gume-Bissan.using polymerase chain reation of the multiple-banded entigen gene［J］.clin.Lab.Anal.2002,16(2):71.