神农香菊提取物的高效液相色谱指纹图谱研究

【摘要】  目的建立神农香菊提取物黄酮类成分高效液相色谱(HPLC)指纹图谱。方法采用反相高效液相色谱法， 色谱柱为DIONEX-ACCLAIM.120 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为 磷酸盐缓冲溶液（pH=2.5）-甲醇(梯度洗脱)；流速为0.8 ml/min；柱温35 ℃；检测波长350 nm。结果建立了神农香菊提取物黄酮类成分HPLC指纹图谱，标定了16个共有指纹特征峰，方法学考察符合指纹图谱技术要求。结论方法稳定，可靠，精密度高，重复性好，可为神农香菊提取物质量标准的制定提供科学依据。

【关键词】  神农香菊； 提取物； 高效液相色谱； 指纹图谱

　　Abstract：ObjectiveTo establish the HPLC fingerprint spectrum of flavonoids in extract of Dendranthema indicum. MethodsThe HPLC conditions with DIONEX-ACCLAIM 120 C18 column（250mm×4.6mm，5μm）was used， the mobile phase was composed of methy1 cyanide and pBS(pH=2.5) with gradient elution;flow rate was 0.5ml/min;column temperature was 35℃, the detection wavelength was 350nm, and the recording time was 140 min. ResultsTen common characteristic peaks were taken as fingerprint peaks and the prease and the ratest were in accordance with the requirement.ConclusionThe method is stable， reliable， precise and it provides a scientific basis for the quality standard of the extract of Dendranthema indicum.

　　Key words：Dendranthema indicum;   Extraction;   HPLC;   Fingerprint Spectrum
   
　　神农香菊提取物为菊科植物神农香菊Dendranthema indicum (L．) Des Mon1．var．aromaticum Q.H.Liu et S．F．Zhang的干燥头状花序［1］经加工制成的提取物，具有疏风清热、平肝明目、散风降压的功效，其主要化学成分为黄酮类化合物，它可用于医药、饮料、香烟及化妆品等产业。文献报道未见神农香菊化学成分的指纹图谱研究。为了保证质量，本文采用高效液相色谱法，建立了神农香菊提取物黄酮类成分的指纹图谱。经过系统适用性试验和方法学考察，发现神农香菊提取物的指纹图谱具有系统性、全面性和特征性的特点，可以有效地鉴别神农香菊提取物，为全面评价和控制神农香菊提取物的质量提供了科学依据。

　　1  仪器与试药

　　1.1  仪器DIONEXULTIMATE 3 000液相色谱仪，Starsorius BSI型电子分析天平（d=0.01 mg，北京赛多利斯天平有限公司），Up520H超声波清洗机（熊猫集团南京电子计量有限公司），DIONEXACCLAIM.120 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱。
 
　　1.2   试药甲醇（美国天地公司）为色谱纯，磷酸（上海振兴化工一厂）为分析醇，磷酸二氢钾（上海实验试剂有限公司），水为双蒸水。

　　1.3  对照品与供试药材木犀草素对照品（中国药品生物制品检定所，批号111520200201）；神农香菊提取物共10批，由10批神农香菊原药材制备，原药材经湖北中医学院中药鉴定教研室陈科力教授鉴定为菊科植物神农香菊Dendranthema indicum(L．)Des Mon1．var．aromaticum Q.H.Liu et S．F．Zhang.的干燥头状花序。见表1。
　　
　　2  方法和结果

　　2.1   色谱条件 DIONEXACCLAIM.120 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；以磷酸缓冲盐水溶液（pH=2.5）为流动相A，以甲醇为流动相B，按表2进行梯度洗脱；流速0.5 ml/min；检测波长为350 nm；柱温35℃，理论塔板数按木犀草素峰计算应不低于3 000。

　　2.2  实验溶液的制备

　　2.2.1  对照品溶液的制备 精密称取木犀草素对照品适量，加甲醇制成每毫升含1.0 mg的溶液，即得对照品溶液。

　　2.2.2  供试品溶液的制备 取本品粉末（过2号筛）0.2 g，精密称定，精密加入甲醇20 ml，称定重量，超声提取30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，过滤，滤液置蒸发皿中蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至50 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。表1  不同来源的神农香菊样品（略）

　　表2  流动相梯度洗脱表（略）

　　2.3  方法学考察及相似度计算

　　2.3.1  精密度研究   精密吸取1号供试品溶液5 μl，按“2.1”项色谱条件，连续进样5次，以木犀草素峰(峰8)作为参照峰，指定其α值为1.000，考察仪器精密度，各特征指纹峰相对保留时间和特征指纹峰相对峰面积分别在0.3%～2.1%和0.2%～2.1%之间，均小于3%，符合指纹图谱的要求。

　　2.3.2  稳定性研究取同一3号供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，分别于0，3，6，9，12，24h进行检测，以木犀草素峰为参照，指定其α值为1.000，考察供试品溶液的稳定性，各特征指纹峰相对保留时间和特征指纹峰相对峰面积分别在0.2%～1.2%和0.4%～2.6%之间，均小于3%，符合指纹图谱的要求。
 
　　2.3.3  重复性研究 取本品5号粉末（过2号筛）5份，每份0.2 g，精密称定，照“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，以木犀草素峰为参照，指定其α值为1.000，考察方法的重复性，各特征指纹峰相对保留时间和特征指纹峰相对峰面积分别在0.1%～1.0%和0.7%～2.4%之间，均小于3%，符合指纹图谱的要求。

　　2.4  指纹图谱及技术参数   取样品粉末（过2号筛）10批，每份0.2g，照“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进行测定。选定木犀草素峰作为参照，指定的α值为1.000，特征指纹峰相对保留时间和特征指纹峰相对峰面积（自然对数相对比）的结果见表3～4。

　　表3  神农香菊提取物共有特征指纹峰相对保留时间（略）

　　表4  神农香菊提取物共有特征指纹相对峰峰面积（略）

　　通过对10批神农香菊提取物指纹图谱的HPLCFPS和不同样品间HPLCFPS的比较，建立神农香菊药材对照指纹图谱，各样品指纹图谱特征峰与对照指纹图谱特征峰有良好的重复性，神农香菊指纹图谱应有16个特征峰。见图1～2。

　　2.5  相似度计算 根据中国药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版，计算了神农香菊10批提取物的相似度，结果分别为0.911，0.9。

　　3  小结

　　3.1  色谱柱选择研究 本实验研究选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，曾使用过Diamasil（200 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent ZOBAX SBC18(250 mm×3.0 mm，5 μm)、TURNER KromasilITM（4.6 mm×250 mm，5 μm）及DIONEXACCLAIM.120 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），最后根据色谱峰的分离效果及稳定性等因素综合考虑，选择使用DIONEXACCLAIM.120 C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色谱柱。

　　图1  神农香菊提取物对照指纹图谱（略）
 
　　3.2  流动相的选择流动相的选择曾使用过甲醇-水、乙腈-水、甲醇0.4%磷酸流动相进行等度及梯度洗脱，结果木犀草素的色谱峰对称性差且各色谱峰分离度不好，最后根据分离情况和色谱峰的对称性选择以磷酸缓冲盐水溶液（pH=2.5）为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱效果最佳。

　　图2  10批神农香菊提取物对照指纹图谱叠加图（略）

　　3.3  10批提取物指纹图谱相似度评价 10批不同产地神农香菊提取物样品的指纹图谱面貌基本一致，由各产地神农香菊提取物指纹图谱相似度性良好（r﹥0.90），反映了药材的同源性，可以用来作定性鉴别。本方法稳定、可靠、重复性好，可为神农香菊提取物及其制剂质量标准的拟定提供参考依据，也为含神农香菊提取物的中药方剂物质基础研究与配伍规律提供分析方法。

【参考文献】
  ［1］ 刘启宏，张树藩.神农架菊属一新变种［J］.武汉植物学研究，1983，1（2）:237.