二至丸与失笑散对胆汁淤积性肝纤维化大鼠uPA的调控

【摘要】  目的研究不同治则中药复方二至丸与失笑散对胆汁淤积性肝纤维化大鼠uPA/PAI-1纤溶途经的调控作用。方法SD雄性大鼠60只随机分为假手术组和造模组, 造模组于1周后随机分为模型对照组、二至丸组、失笑散组及合方组。各治疗组分别给予相应药物灌胃,模型对照组和假手术组给予等量生理盐水灌胃,4周末处死大鼠。观察内容包括一般情况、肝功能、肝组织病理、Western 印迹法检测uPA蛋白表达、RT-PCR法检测肝组织PAI-1的表达。结果与模型对照组比较,3个中药复方均能降低胆汁淤积性肝纤维化大鼠血清ALP，ALT，AST水平（P<0.01）,失笑散及合方能降低TBil（P<0.01）;合方改善ALP，ALT优于两个单方。3个复方均能不同程度地减轻模型大鼠肝纤维化程度（P<0.01）,合方优于两个单方。3个复方均能显著降低胆汁淤积性肝纤维化大鼠PAI-1 mRNA表达（P<0.01），提高uPA的表达（P<0.05，P<0.01）。合方对上述环节的调控优于两个单方。结论不同治则中药复方均能改善胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝功能，减轻纤维化程度,合方作用优于两个单方，其机制可能与通过调控uPA/PAI纤溶途径有关。

【关键词】  胆汁淤积性肝纤维化；二至丸；失笑散； 尿激酶型纤溶酶原激活物；尿激酶型纤溶酶原激活物抑制物

　　Effects of Erzhiwan and Shixiaosan on Urokinase-type Plasminogen Activator in Cholestasis-induced Liver Fibrosis Rats

　　CHEN Junming, AN Deming, LIU Tao, ZHENG Peiyong, XING Lianjun, JI Guang

　　1.Institute of Spleen-stomach, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China; 2.Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China; 3.E-institute, Shanghai  University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China

　　Abstract：ObjectiveTo study the regulatory effects of the Chinese medicine complex prescriptions Erzhiwan and Shixiaosan on urokinase type plasminogen activator（uPA）/ plasminogen activator inhibitor-1 ( PAI-1) fibrinolytic system cholestasis-induced liver fibrosis rats .MethodsSixty male Sprague-Dawley (SD)rats were randomly pided into 2 groups: Sham operation group and model group. Bile duct ligation method was used to make the model of cholestasis-induced liver fibrosis. One week later, after operation, the model group rats were randomly pided into four groups :Untreated group , Erzhiwan group , Shixiaosan group and Erzhiwan compound with Shixiaosan(ECS) group .Each medicine intervention group was given corresponding medicine by intragastric administration. Sham operation group and untreated group were given sodium chloride with equal dosage. At the end of 4th week , all of the rats were sacrificed and sampled. General state of health , hepatic function (alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST),alkaline phosphatase(ALP), total bilirubin(TBil), and pathological histology of hepatic tissue were recorded and measured. uPA was detected with reverse transcription-polymerase chain raction (RT-PCR) and PAI-1with western blot.ResultsThe serum ALP , ALT and AST levels in three Chinese medicine complex prescription group rats and the serum level of TBil in Shixiaosan and ECS group rats were decreased compared with model group (P<0.01).ECS was better than simple recipe in ALP and ALT. All of three complex prescriptions could inhibit liver fibrosis to some extent (P<0.01) , but ECS was  more obviously than simple recipe.PAI-1mRNA expression was significantly decreased and uPA expression was significantly increased in the above three Chinese medicine complex prescription groups as compared to model group(P<0.01),ECS group was the lowest or highest .ConclusionChinese mdeicine complex prescriptions ( Erzhiwan , Shixiaosan and ECS) can improve the Hepatic function of cholestasis-induced liver fibrosis rats, alleviate hepatic fibrosis,and ECS is better than simple recipe. The mechanism may be related to regulating the uPA/ PAI-1 fibrinolytic system.

　　Key words：cholestasis-induced liver fibrosis ; Erzhiwan; Shixiaosan; uPA;   PAI-1

    肝纤维化的本质是细胞外基质(extracellular matrix ,ECM)合成增多而降解相对减少，使过多的ECM 沉积于肝内。肝星状细胞(hepar stellate cell, HSC)是调控肝脏ECM 沉积的最重要细胞，其激活是肝纤维化发生的中心环节。HSC对ECM 调节的重要途径之一就是通过尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)和其抑制物(PAI)的差异表达，调控纤溶酶和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)家族的活性，以维持ECM 合成与降解之间的平衡。祖国医学普遍认为, “正虚血淤”是肝纤维化的基本病机［1］。本研究旨在观察补益肝肾和活血化淤的经典名方二至丸和失笑散及其合方对大鼠胆汁淤积性肝纤维化形成的影响及其对uPA/PAI的调控作用,为中医药防治以细胞外基质沉积为特征的肝纤维化提供更广阔的途径。

　　1  材料与仪器

　　1.1  动物

　　SD雄性大鼠60 只, SPF 级,体重(260±20) g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,许可证号: SCXK (沪) 2003 - 0003。饲养于上海中医药大学附属龙华医院实验动物中心, 自由饮食。

　　1．2 试剂与器材

　　盐酸氯胺酮(上海第一生化药业公司,国药准字：H31021897 ); HE、天狼猩红染液(上海虹桥乐翔医用试剂有限公司) ;血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、血清门冬氨酸氨基转移酶（AST）、血清总胆红素（TBil）、血清碱性磷酸酶（ALP）试剂盒(南京建成生物工程研究所) ; DEPC ( Sigma ) ; Trizol Rea-gent、 AMV RT/ PCRKit、DNAMarker 、引物合成(上海申能博彩生物科技有限公司);UV-2102C分光光度计(尤尼克公司) ; PCR 仪、DNA水平(Biorad) ;RNA/DNA calculator( Pharmacia ) ;凝胶成像系统(上海四星生物技术有限公司); uPA抗体试剂盒(Santa Cruz Biotechnology INC)。

　　1.3 药物制备　

　　二至丸出自清·汪昂《医方集解》，由旱莲草、女贞子等份（各9 g）组成; 失笑散出自宋·《太平惠民和剂局方》, 由五灵脂、蒲黄等份（各6 g）组成; 合方: 由旱莲草、女贞子各9 g , 五灵脂、蒲黄各6 g组成。根据大鼠剂量=人剂量×35 (人转换因子) / 6 (大鼠转换因子)计算出人鼠等效剂量二至丸为175 g·kg- 1  ·d -1 , 失笑散为1.17 g ·kg - 1 ·d- 1  , 合方为2.92 g ·kg - 1 ·d - 1 ,均按传统工艺制备成水煎剂, 减压浓缩分别至1.75，1.17，2.92 g/ ml 备用(所有药物制备、质控由上海中医药大学附属龙华医院制剂中心完成)。

　　2 方法

　　2.1 模型制备

　　参照文献［2］采用胆管结扎复制胆汁淤积性肝纤维化模型。术前禁食不禁水12 h，盐酸氯胺酮100 mg/ kg 肌肉注射麻醉，常规腹部皮肤消毒，沿腹正中线切开皮肤，暴露胆总管，于远近端结扎胆总管，中间离断，关腹；假手术组仅开腹暴露并游离胆总管不结扎, 关腹。

　　2.2 动物分组及给药

　　将大鼠随机分为假手术组10 只,其余50 只为造模组, 术后因结扎线脱落、消化道出血及腹水等原因有8只死亡，造模1 周后, 造模组随机分为模型对照组(12 只) , 二至丸组、失笑散组及合方组（各10 只）。术后1周开始,各治疗组分别给予相应药物灌胃, 1 次/ d , 共计3 周;假手术组与模型对照组以同体积生理盐水灌胃。4 周末以盐酸氯胺酮腹腔注射麻醉(100 mg ·2 ml- 1 ·kg- 1 ), 腹主动脉采血, 处死全部实验动物, 分离血清, - 80 ℃保存备用。摘取肝脏称重后, 于肝右叶切取1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小肝组织2块, 4 %中性甲醛溶液固定,剩余肝脏- 80℃条件下保存备用。

　　2.3 指标检测

　　2.3.1  一般情况　

　　包括精神状态、活动情况、皮毛光泽度、食量、大小便情况等。

　　2.3.2 肝脏形态包括肝脏的外形、色泽、质地。

　　2.3.3 生化指标测定　ALT，AST，TBil ，ALP按试剂盒说明书操作。

　　2.3.4 病理学检测

　　HE 染色、胶原纤维染色(天狼猩红染色) 、肝纤维化程度分级标准［3］：汇管区纤维组织无增生为“-&

rdquo;; 增生后面积占肝小叶1/ 3 以下为“+”; 占肝小叶1/ 3～2/ 3 为“+ +”; 占肝小叶2/ 3 以上为“+ + +”。每个“+”记1 分, 每个标本记总分。积分越高, 表明肝脏纤维化程度及病理损害越严重。

　　2.3.5 Western 印迹法检测

　　肝组织中uPA蛋白含量 取- 80℃保存的肝组织标本各100 mg, 剪碎后于液氮中研磨成粉末状, 收集于Eppendorf管后,提取肝组织蛋白匀浆, 以紫外分光光度计(650 nm)测定蛋白浓度。 取含60 μg蛋白肝组织匀浆, 变性处理后经10% SDS-PAGE电泳分离, 4℃条件下经2～3 h将蛋白电转移至硝酸纤维素膜, 置膜于含50 g/L脱脂牛奶中(TBST缓冲液稀释)封闭1 h。 分别加入特异性兔抗鼠uPA mAb(1∶1 000稀释)、鼠抗鼠β-actin mAb及辣根过氧化物酶标记的抗兔、抗鼠多克隆抗体(1∶5 000稀释)进行免疫反应,以增强化学发光显色系统显色, 超敏胶片曝光,以β-actin为内参照。

　　2.3.6 RT-PCR 法检测

　　肝组织PAI-1 mRNA 表达　取- 80 ℃保存的大鼠肝组织标本, 匀浆后用TRIZOL 试剂抽提总RNA。采用分光光度法测定提取的总RNA 含量及纯度, OD260/ OD280 在1.8～2.0 之间。引物序列： PAI-1(+)  GTG GTT CGG CAC AAT CCA ACA GAG(1 268),PAI-1 (-)GCA ATG GAG GAC GAT ACA AGA GGT (1 709)。β-actin(+) TGT GAT GGT GGG TAT GGG TCA GAA G(207),β-actin(-) TCA CGG TTG GCC TTA GGG TTC AGA G(431); PCR 扩增: 49 μl 体系:1st strand cDNA 5 μl , 10×PCR Buffer 5μl , dNTP 1μl , 目的基因正负链各2μl ,β-actin正负链各2 μl , H2O 29 μl , Taq 酶1 μl ; PCR循环条件: 95 ℃预变性5 min, 95℃30 s, 60℃40 s, 72℃1 min, 30次循环, 72℃10 min。PCR 产物加样于2%琼脂糖凝胶, 电泳（上样量12 μl，6×DNA loading buffer 2 μl，电压150 v，电泳35 min）紫外灯下观察, 凝胶分析系统拍照, 计算机图像扫描和吸光度值分析, 计算PAI-1/β-actin mRNA 的相对表达量。

　　2.4 统计分析

　　各组计量资料以±s表示, 计量资料采用方差分析, 等级资料采用秩和检验, 应用SPSS 12.0 软件进行分析, P < 0.05 为差异有统计学意义。

　　3 结果

　　3.1 动物一般情况变化　

　　假手术组大鼠毛发有光泽, 体重增加, 体态活泼, 食量及二便正常。胆管结扎大鼠2～3  d后出现小便发黄, 术后7 d, 出现尾部黄染、耳黄、毛黄染等黄疸表现。

　　3.2 肝脏形态变化　

　　假手术组肝脏表面光滑, 呈红褐色, 质地软。模型对照组大鼠肝脏体积增大, 表面黄染, 质地较硬。3 个中药复方组大鼠肝脏体积较模型组小, 表面较模型对照组光滑。

　　3.3 不同治则中药复方对模型大鼠肝功能的影响

　　结果见表1。表1  不同治则中药复方对模型大鼠肝功能的影响（略）
 
　　3.4 不同治则中药复方对模型大鼠肝组织病理的影响　

　　HE及天狼猩红染色显示， 假手术组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐， 呈放射状，肝窦正常，胞核结构清晰。模型对照组大鼠肝脏内小胆管大量增生， 以汇管区为中心呈放射状向肝实质内延伸， 增殖的胆管呈花环样，胆管上皮细胞周围有肌成纤维细胞的聚集和细胞外基质的沉积；肝细胞与增生的胆小管相比明显减少，剩余肝细胞的形态结构尚正常。与模型对照组比较，3个中药组小胆管增生较模型组明显减少，剩余肝细胞量较多；合方组较两个中药单方组病理改变轻，失笑散组和二至丸组无明显差异；模型及药物组的炎症及坏死均不明显。结果见表2。表2  不同治则中药复方对模型大鼠纤维化程度的影响（略）

　　3.5 不同治则中药复方对模型大鼠肝组织uPA蛋白表达的影响

　　Western blot检测显示，假手术组大鼠肝组织uPA表达极低，模型对照组uPA表达显著高于假手术组（P<0.01），与模型对照组比较，失笑散组、二至丸组及合方组uPA表达显著增强（P<0.01），3个中药复方组之间比较，合方组最高，失笑散组次之，再次为二至丸组，3者之间统计有显著差异（P<0.05，P<0.01）。见图1。

　　3.6 不同治则中药复方对模型大鼠肝组织PAI-1 mRNA 表达的影响　

　　RT-PCR 检测显示，与假手术组比较, 模型对照组PAI-1 mRNA 表达显著增强(P<0.01) , 与模型对照组比较, 失笑散组、二至丸组及合方组PAI-1 mRNA 表达显著降低(P<0.01) , 3 个中药复方组之间比较, 合方组最低, 二至丸组次之, 再次为失笑散组,3者之间比较差异有显著性意义(P<0.01)。见图2 。

　　4 讨论

    肝纤维化属于中医“黄疸”“胁痛”“积聚”“臌胀”等范畴。“正虚血淤”是肝纤维化的基本病机。二至丸及失笑散是补益肝肾和活血化瘀的经典方剂。 已有研究表明，二至丸可以改善慢性乙型肝炎患者的症状和肝功能, 降低四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的ALT 水平［4，5］及治疗肝纤维化的作用［6］。失笑散联合金铃子散治疗肝硬化腹水有较好疗效［7］。

    胆管阻塞性肝纤维化动物模型与CCl4 、二甲亚硝胺以及异源血清(如人或牛血清白蛋白或猪血清) 诱导的肝纤维化模型相比， 具有造模过程中炎症反应轻、肝组织内无肝细胞坏死灶,除汇管区胆汁溢出部有轻度单核细胞浸润外,炎性细胞少见［8］ ；纤维组织增生明显；纤维化形成快［9］；形成后短期内不自发逆转；实验指标稳定等特点。在研究肝纤维化的发病机制、筛选非创伤性肝纤维化血清学诊断指标、新药开发等研究方面具有独特的应用价值，已被广泛应用于肝纤维化研究。
   
　　目前研究证实，肝纤维化表现肝脏ECM在肝脏的大量沉积，而ECM的降解受多种因素的调控，近来有研究显示纤溶酶原激活剂( PA) 通过PA-纤溶酶-MMPs 级联反应途径, 最终可产生活化的纤溶酶和MMPs , 后两者是降解ECM 各组分的重要物质。纤溶酶原激活物包括组织型(tPA)和尿激酶型(uPA)，tPA主要参与纤溶过程，溶解血栓，防止血栓形成；uPA主要作用于生理病理条件下细胞迁移、组织重建、肿瘤浸润及转移等过程，其中包括细胞外基质降解过程。uPA与细胞表面的uPAR特异性结合可使细胞表面的纤溶酶原转变为纤溶酶，纤溶酶可通过两种途径来参与基质降解。第1种途径是直接降解基质成分，纤溶酶是一种作用广泛的丝氨酸蛋白水解酶，可直接降解多种细胞外基质成分，如纤维蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和蛋白多糖等；第2种途径是通过激活MMPs酶原，参与细胞外基质的降解［10］。通过这两种途径，纤溶酶能降解大部分基质成分。Ⅰ型纤溶酶原激活剂抑制剂( PAI-1) 是纤溶系统的主要抑制物, 有研究证实, 人体肝内PAI-1 含量及活性最高, 血浆PAI-1 亦具有肝源性, 故认为肝脏是PAI-1 的主要来源［11］。PAI-1和PA是调节纤溶系统的重要成分, 两者的平衡维持着纤溶系统功能的正常,在肝脏纤维化的过程中, 这种平衡的失调会促进胶原、糖蛋白、蛋白多糖等ECM的合成增加, 并在肝组织内沉积形成纤维组织, 从而促进肝脏纤维化的形成和肝硬化的出现。PAI-1 基因缺失可以延缓纤维化进程［12，13］。大鼠酒精性肝病研究发现, 在肝损伤早期尚未出现明显组织病理学改变时,即可诱导PAI-1 基因在转录水平的过度表达［14］。临床研究也证实慢性乙型肝炎患者PAI-1 蛋白表达着色积分随肝纤维化加重而显著升高［15］。在胆汁淤积性肝纤维化的研究中发现,胆管阻塞两周时而且与野生鼠比较,PAI-1 基因敲除鼠uPA、MMP-2 及MMP-9活性明显增加, 肝纤维化明显减轻; 同时发现基因敲除鼠早期肝损伤明显减轻, 只是这种保肝作用为时短暂。进一步研究表明PAI-1 基因缺失延缓肝纤维化进程是由于促进了细胞外基质降解［16］。胆汁淤积造成肝纤维化的机理复杂, 但是有一病理学共同点即胆管上皮细胞增生。
   
　　本实验运用二至丸和失笑散及其合方使胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝脏小胆管增生较模型组明显减少,相对肝细胞量剩余较多。 在改善纤维化方面, 合方效果优于两个单方; 与模型组比较,失笑散和合方能够显著降低胆管结扎所致的TBil 、ALP、AST、ALT , 二至丸能降低ALP、AST、ALT 活性, 但对TBil 无改善。在改善TBil 方面, 合方和失笑散之间无差异; 合方在改善ALP、ALT 方面,

优于两个单方; 对AST 的疗效, 合方优于二至丸, 与失笑散无差异; 两个单方在降低ALP、AST、ALT 上均无差异。 三个复方均能上调uPA蛋白表达而下调PAI-1mRNA 表达;合方效果优于两个单方, 且与病理和生化结果一致。综上所述，三方终效应均表现为对PAI-1含量和活性的抑制,对uPA含量和活性相对增高，从而促使纤维组织降解，阻止肝纤维化的形成和进展。这既提示了二至丸、失笑散及其合方治疗肝纤维化的作用途经，又提示对胆汁淤积性肝纤维化的中药治疗应当采用综合治疗方法。

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