黄芩苷对抗结核药物肝损伤保护作用的实验研究

【摘要】  目的探讨黄芩苷对抗结核药物肝损伤的保护作用机制。方法将60只小鼠完全随机分为6组，即正常对照组，肝损伤 (异烟肼+利福霉素钠) 组，联苯双酯组及黄芩苷高、中、低剂量组。给药8 d后，分别用光镜和电镜观察肝脏组织细胞病理学的改变情况，用免疫组织化学染色技术分析肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达情况。结果黄芩苷能明显减轻肝细胞变性和坏死，炎症活动程度明显减轻（P<0.05 或P<0.01 ）；TNF-α蛋白在黄芩苷组小鼠肝脏组织内为弱阳性表达（P<0.05 或P<0.01 ）；黄芩苷3个剂量组间小鼠肝脏病理形态学及肝脏组织内TNF-α蛋白的表达均无显著性差异（P>0.05）。结论黄芩苷对抗结核药物肝损伤的保护作用可能与抑制TNF-α蛋白表达有关。

【关键词】  黄芩苷；抗结核药物；肝损伤；肿瘤坏死因子-α；免疫组织化学

　　An Experimental Study on Protective Effects of Baicalin on Hepatic Injury Induced by Antituberculosis Drugs

　　WANG Xinhua,JIN Dongling, HE Hongmei,ZHANG Yanxia,SHI Zhimin, ZHAO Rutong

　　Medical College, Hebei Engineering University, Handan, Hebei 056002,China

　　Abstract：Objective To investigate the protective effects of baicalin on the hepatic injury induced by antituberculosis drugs in mice. MethodsSixty mice were pided randomly into 6 groups: normal control group, liver injury isoniazid and rifamycin sodium group, positive control group, baicalin groups(high, middle and low doses ). The drugs were administered to mice once daily for 8 days. Light microscope and electronic microscope were used respectively to observe the histopathological changes of the hepatic cells. The expression of tumor necrosis factor-α (TNF-α) was detected by immunohistochemistry. ResultsBaicalin alleviated the degeneration and necrosis induced by antituberculosis drugs obviously. The level of inflammatory activity was relieved significantly (P<0.05, P<0.01).  The immunoreactivity of TNF-α protein in liver cells was slightly stained in baicalin groups (P<0.05, P<0.01). There were no significant differences about the pathomorphology, the inflammatory activity and the express of TNF-α protein among baicalin groups (P>0.05). ConclusionThe protective effects of baicalin on hepatic injury induced by antituberculosis drugs may be related to inhibit TNF-α protein expression.

　　Key words：Baica1in;  Antituberculosis drugs;   Hepatic injury; Tumor Necrosis Factor-α;   Immunohistochemistry
   
　　结核病患者在化疗过程中遇到的最棘手问题之一是应用的抗结核药物对肝脏的损害［1～3］，它可导致化疗中止，甚至危及患者的生命。本实验前期研究已证实黄芩苷对异烟肼和利福霉素钠所致肝损伤具有较好的保护作用［4］，但是这种保护作用机制还不清楚。本实验试图通过免疫组织化学技术及病理形态学超微结构观察探究黄芩苷对抗结核药物致小鼠肝损伤的保护作用机制。

　　1 材料

　　1.1  药物与试剂

　　黄芩苷（承德颈复康药业集团雾灵药业有限责任公司，批号：050920）；异烟肼注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批号：0505101）；利福霉素钠注射液（沈阳双鼎制药有限公司，批号：05080802）；联苯双酯滴丸（德州德药制药有限公司，批号：050501）；兔抗小鼠TNF-α单克隆抗体和即用型SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司， 编号：SA2041）。

　　1.2 动物健康

　　清洁级KM小鼠60只，♀♂兼用，体重18～22 g，由河北医科大学实验动物中心提供。

　　2 方法

　　2.1 动物分组及处理

　　将60只小鼠完全随机分为6组，每组10只，即正常对照组，肝损伤（利福霉素钠+异烟肼）组，联苯双酯组和黄芩苷高、中、低3个剂量组。正常对照组灌胃给予0.9%氯化钠注射液0.2 ml·(10 g)-1·d-1,共8 d；肝损伤组腹腔注射0.25%利福霉素钠0.2 ml·(10 g)-1·d-1和灌胃给予0.3%异烟肼 0.2 ml·(10 g)-1·d-1,共8 d；联苯双酯组在给予利福霉素钠和异烟肼(剂量及给药方式同肝损伤组)1 h后灌胃给予1.0%联苯双酯0.2 ml·（10 g）-1·d-1,共8d；黄芩苷分3个剂量组，在给予利福霉素钠和异烟肼(剂量及给药方式同肝损伤组)1 h后分别灌胃给予不同浓度(即1.0%,0.5%和0.25%)黄芩苷0.2 ml·（10 g）-1·d-1,共8 d。全部动物末次给药后禁食16 h。第9天将小鼠拉颈椎脱臼致死，立即剖开腹腔取出肝脏。

　　2.2 肝脏组织病理形态学观察 

　　取上述小鼠肝脏右叶部分，以10%中性福尔马林固定，常规石蜡切片，HE染色，光镜下观察肝脏组织病理学变化。炎症活动度计分标准参照王泰龄等［5］提出的慢性肝炎炎症活动度计分方法，分为汇管区炎症（P）、小叶内炎症（L）、碎屑坏死（PN）及桥接坏死（BN，包括分小叶坏死）4项，每项依病变程度分别计为1，2，3，4分，因为PN、BN的严重程度与预后直接相关，因而计分2倍于其他病变，计分公式为：P+ L+2×（PN+BN）。

　　2.3 肝脏组织TNF-α蛋白免疫组化检测 

　　免疫组织化学染色按SABC试剂盒说明书进行。一抗为兔抗小鼠TNF-α。玻片经多聚赖氨酸防脱片处理，小鼠肝组织切片用0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）进行微波抗原修复，其余步骤按试剂盒说明书进行。DAB显色，苏木精复染，中性树脂封片。以PBS代替一抗做阴性对照。免疫组织化学染色结果用病理图像分析系统分析TNF-α表达情况并测量其灰度值。

　　2.4 肝脏组织透射电镜观察

　　取肝组织块切成约1 mm×1 mm×1 mm 后，用2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，漂洗，逐级脱水、浸透、固化，制成超薄切片后，在日立H-7500 透射电镜下观察肝脏细胞的超微结构变化。

　　2.5 统计学方法

　　数据均以±s表示。组间显著性检验采用unpaired t test，多组与对照组的两两比较用Dunnett t检验。统计学分析使用InStat-3软件。

　　3 结果

　　3.1 HE染色肝脏组织病理观察

　　正常对照组小鼠肝小叶结构清楚，肝细胞索排列整齐，肝细胞形态正常，核结构清晰，肝窦正常。肝损伤组小鼠肝细胞弥漫性水肿，胞浆疏松化和气球样变，肝细胞碎片状坏死，散在有肝细胞凋亡。黄芩苷高中低3个剂量组小鼠的肝小叶结构清楚，肝细胞基本正常，核结构清晰，少数肝细胞轻度水肿，并且有肝细胞再生现象。联苯双酯组小鼠肝细胞弥漫性轻度水肿，有肝细胞点状坏死。黄芩苷3个剂量组间小鼠肝脏病理形态学无明显差别，并且与联苯双酯组间病理形态学比较亦无差别。与正常对照组比较，肝损伤组小鼠肝脏组织炎症活动度计分升高有显著性（P<0.01）；与肝损伤组比较，黄芩苷3个剂量组和联苯双酯组小鼠肝脏组织炎症活动度计分降低有显著性（P<0.05，P<0.01）；但黄芩苷3个剂量组间小鼠肝脏组织炎症活动度计分无显著性差异（P>0.05），并且与联苯双酯组间比较亦无显著性差异（P>0.05）。炎症活动度计分情况见表1。表1  各组小鼠炎症活动度计分情况的比较(略)

　　3.2 肝脏组织TNF-α免疫组化染色结果

　　正常对照组小鼠肝脏组织内TNF-α蛋白无表达；联苯双酯组和黄芩苷3个剂量组小鼠肝脏组织内TNF-α蛋白均主要表达于中央静脉周围的少数肝细胞，表达强度为弱阳性（±～ +）；肝损伤组TNF-α蛋白在绝大多数小鼠肝细胞内均有强阳性表达（+++），包括中央静脉周围的肝细胞和汇管区附近肝细胞，阳性物质主要分布在胞质和胞核。与正常对照组比较，肝损伤组小鼠肝脏组织中TNF-α蛋白表达升高有显著性（P<0.01）；与肝损伤组比较，黄芩苷3个剂量组和联苯双酯组小鼠肝脏组织中TNF-α蛋白表达降低有显著性（P<0.05或P<0.01）；但黄芩苷3个剂量组间小鼠肝脏组织中TNF-α蛋白表达无显著性差异（P>0.05），并且与联苯双酯组间比较亦无显著性差异（P>0.05）。TNF-α 在各组小鼠肝脏组织中表达情况见表2。表2  TNF-α 在各组小鼠肝脏组织中表达情况的比较（略）

　　3.3 肝细胞超微结构改变

　　正常对照组小鼠肝细胞形态、线粒体、粗面内质网均正常。肝损伤组小鼠肝细胞内线粒体空泡化，嵴膜融合、消失，髓样变性，粗面内质网脱颗粒，糖原数量显著减少。黄芩苷3个剂量组小鼠肝细胞结构均基本正常，仅个别线粒体轻度水肿、嵴融合、粗面内质网有脱颗粒现象。联苯双酯组肝细胞有部分线粒体变性，嵴膜融合，糖原数量减少，粗面内质网脱颗粒，细胞质水肿。

　　4 讨论

    近年来的研究表明［6,7］，各种急、慢性肝病的发病过程均与肝细胞的异常凋亡有关。在病毒性肝炎患者的肝组织中肝细胞凋亡与坏死同时存在，患者体内还有TNF-α等多种细胞因子水平的升高，细胞因子水平的升高又加重了肝损害。TNF-α可通过诱导肝细胞凋亡参与肝脏疾病的发病过程，TNF-α是肝坏死发生中的一种重要的细胞因子，TNF-α被认为是介导肝损伤的主要和终末介质,且与肝损伤程度呈明显正相关，TNF-α水平越高，肝病越重［8］。研究还发现，内毒素血症时，内源性TNF-α增加，肝细胞膜上TNF-α受体表达也明显上调［9，10］ ，说明TNF-α/TNF-α受体途径在内毒素血症肝细胞凋亡中发挥一定作用，TNF-α通过其受体，导致肝细胞凋亡，引起炎症细胞浸润和肝组织坏死。而抗结核药物所致肝损害的病理变化与慢性乙型肝炎比较，本质上无明显差别［1］，推测异烟肼和利福霉素钠的肝损伤是否也有肝细胞凋亡机制的参与。因此，从肝细胞凋亡的角度探讨黄芩苷对异烟肼和利福霉素钠所致小鼠肝损伤的保护作用机制意义重大。
   
　　黄芩苷是中药黄芩中的主要成分，它具有黄芩的基本作用，并体现出其更显著的抗氧化、抗病毒、调节免疫、解热、抗感染等药理作用。肝组织损伤与病毒感染、炎症、过氧化反应、自身免疫系统失衡等息息相关。实验研究已证实，黄芩苷对化学和免疫实验性肝损伤均有一定的保护作用，这与它具有显著的抗氧化、免疫调节以及清除自由基作用有关［11，12］。本实验的前期研究亦表明，黄芩苷高、中、低3个剂量组均能显著降低由异烟肼和利福霉素钠所致的小鼠血清ALT和AST活性的升高，并使肝损伤小鼠的肝指数降低，具有较好的肝脏保护作用［4］。体外研究已表明，不同浓度的黄芩苷均对TNF-α所诱导的体外培养大鼠肝细胞凋亡有抑制作用［13］。本次实验研究显示，黄芩苷3个剂量组小鼠肝细胞的变性和坏死程度较肝损伤组均明显减轻，炎症活动程度明显减轻（P<0.05 或P<0.001 ），肝细胞超微结构较肝损伤组有明显改善，且TNF-α蛋白为弱阳性表达，而肝损伤组TNF-α蛋白在绝大多数小鼠肝细胞内均有强阳性表达。其研究结果说明，异烟肼和利福霉素钠的肝损伤作用机制可能与TNF-α蛋白在肝脏组织细胞的高表达有关，TNF-α在异烟肼和利福霉素钠所致小鼠肝损伤过程中起着重要作用，黄芩苷可能通过抑制TNF-α蛋白的表达，从而减轻肝细胞的凋亡与坏死。

　　本实验已为更深入研究抗结核药物致肝损伤的发病机制以及黄芩苷对其肝损伤的保护作用机制提供了新的方向。古今中医学者都把黄芩作为除肝胆湿热的一味中药，故有必要进一步开展黄芩苷对肝细胞膜、肝细胞器等保护作用机制的研究。

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