近皮层大鼠C6胶质瘤模型的建立研究

【摘要】 目的：建立一种便于开骨窗及肿瘤切除的近皮层大鼠C6胶质瘤模型。方法： 立体定向下将C6细胞接种于大鼠脑皮层、白质交界处，建立近皮层荷瘤鼠模型。取7只模型鼠，分别于接种的第7、11、15天行头颅MRI检查，了解肿瘤的生长情况。行病理HE切片观察、流式细胞DNA细胞周期分析及GFAP免疫组织化学检测，了解肿瘤的生长特性和病理特征。5只荷瘤鼠及2只正常大鼠经尾静脉注入5ALA后，取肿瘤组织及脑组织制成细胞悬液行荧光分光光度分析，探讨血脑屏障的破坏情况。取29只荷瘤大鼠，分成开骨窗组、开骨窗加取瘤组及对照组，观察生存期。结果： 用本法建立近皮层C6胶质瘤模型54只，52只成功建立模型，成功率96.3%。病理、流式细胞、免疫组织化学显示大鼠C6胶质瘤生长特性和病理特征与人脑胶质瘤相似；对照组、开骨窗组及开骨窗加肿瘤切除组生存期分别为（32.000 0±8.981 5）、（41.888 9±6.461 8）、（59.400 0±14.416 0） d。行组间单向方差分析，生存期比较有统计学差异（P<0.05）。结论： 该方法建立的胶质瘤模型稳定，生长特性和病理特征与人脑胶质瘤相似，便于开骨窗及切除肿瘤，是进行胶质瘤研究的较好模型。

【关键词】 近皮层 C6胶质瘤 骨窗 大鼠

胶质瘤大鼠模型仍是目前研究胶质瘤的较好模型。许多学者将C6胶质瘤细胞接种于大鼠的尾状核区，建立颅内荷瘤鼠模型。目前这一方法已相当成熟［13］，缺点是接种的肿瘤位置深在，行手术切除或行热疗、光动力治疗研究时肿瘤显露比较困难。体外细胞实验及皮下荷瘤鼠模型虽然建模简单，但无法准确模拟颅内特殊的病理生理状况特别是血脑屏障的影响。本实验的目的是建立一种便于开骨窗及肿瘤切除的大鼠胶质瘤模型，为研究胶质瘤提供一种选择。

1 材料和方法

1.1 材料

C6细胞株：购自中国科学院上海细胞研究所。SD大鼠54只，雄性，质量260 310 g，购自东南大学医学院实验动物中心。5ALA购自Sigma公司。RMPI 1640为GIBCOL公司产品，胎牛血清购自杭州四季青公司。1.5Tesla MR (东南大学附属中大医院提供使用) ，江湾Ⅰ型C动物立体定向仪及F2500荧光分光光度计（南京航空航天大学提供使用），BD公司产FACScalibur流式细胞仪（南京大学开放实验室）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及动物模型建立 C6细胞常规培养于含10％胎牛血清、青霉素G（100 IU·ml-1）、链霉素（50 μg·ml-1）的RMPI 1640培养基中。培养条件：100 ml培养瓶置于 37 ℃、5％CO2培养箱中，每1 2天换液1次。将处于对数生长期的细胞消化、离心后，用不含血清的RMPI 1640培养基吹打后计数，再次离心洗涤去血清及胰酶后加入不含血清的RMPI 1640（含琼脂糖15 mg·ml-1）制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×104μl-1。大鼠采用4％戊巴比妥钠（1 ml·kg-1）经腹腔麻醉，立体定向仪固定，常规消毒、铺巾、切开，暴露前囟，用牙科钻于中线右3.5 mm、冠状缝后1 mm处钻孔。用25 μl微量注射器将上述细胞悬液10 μl，距离颅骨表面进针3.5 mm,退针0.5 mm,待细胞沉淀充分后注射。注射速度为1 μl·min-1, 注射完毕后留针5 min。骨孔用骨蜡封闭。

1.2.2 肿瘤鉴定 所建立荷瘤鼠7只，于接种后第7、11、15天行俯卧横断位、冠状位、矢状位T1WI、T2WI及增强扫描。扫描参数：T1WI采用SE序列；T2WI采用FSE系列；增强造影剂为钆双胺注射液（Amersham Health 公司），剂量为1.2 ml·kg-1,经尾静脉注射。病理切片：标本经10％甲醛固定，石蜡切片，HE染色。免疫组织化学检查：大鼠经颈总动脉相继以生理盐水及4％多聚甲醛PBS溶液（pH 7.35）灌注固定后取脑，制成石蜡切片，脱蜡水化后与GFAP作免疫组织化学检查，用ABC法染色。流式细胞学检查：取第11天荷瘤鼠，处死后取米粒大小的瘤组织，经剪碎、胰酶消化、过滤、漂洗后用70％乙醇固定，行流式细胞DNA细胞周期分析。

1.2.3 肿瘤对血脑屏障的影响 5只荷瘤鼠及2只正常鼠经尾静脉注入5ALA。4 h后，荷瘤鼠分别取瘤组织、肿瘤周边脑组织及对应的左侧脑叶组织，正常大鼠取右侧相应部位脑组织。组织块约3 mm 大小，经洗净血液后，剪碎、消化、过滤打匀制成细胞悬液，行荧光分光光度计分析。激发波长为402 nm。

1.2.4 颅骨开骨窗，肿瘤切除对荷瘤鼠的影响 取29只近皮层胶质瘤模型，其中开骨窗加肿瘤切除组13只，于接种第11天以接种针道为中心开5 mm×5 mm大小骨窗，暴露瘤组织并在头带式显微镜下切除；开骨窗组大鼠9只，于接种第11天同上法开骨窗，但不切除肿瘤；其余7只荷瘤鼠不予开骨窗，设为对照组。3只开骨窗加取瘤组术后行头颅MRI复查后处死，取脑行病理检查了解肿瘤残余情况。其余所有大鼠观察生存状态和生存期。

1.3 统计学处理

用SPSS 10.0分析，大鼠生存期记作x-±s,行单向方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 模型建立

本实验共接种近皮层C6胶质瘤模型鼠54只。所有大鼠死亡后均取脑，52只接种部位有肿瘤生长，成功率96.3%。2只大鼠脑叶未见有肿瘤生长，但对应在蛛网膜下腔可见有不规则块状瘤组织，考虑与细胞悬液沿针道流入蛛网膜下腔有关。所有接种成功模型中肝、肺、胰、脾、肾未见肿瘤生长。

2.2 MRI

头颅增强扫描示右侧脑叶近皮层高信号占位。第7天荷瘤大鼠占位大小约2 mm×3 mm,厚度约1.5 mm，肿瘤尚未生长到脑表面。11 d荷瘤鼠占位灶可达3 mm×4 mm,厚度约3 mm，灶周出现水肿，中线轻度左偏,见图1。15 d荷瘤鼠占位灶可达4 mm×5 mm，中间厚度可达4 mm，中心可见低信号坏死灶，灶周水肿、中线偏移明显。1只大鼠在接种后出现一皮下转移灶，经MRI及病理证实为C6胶质细胞瘤,见图1。 a.为接种第11天荷瘤鼠，见右侧脑叶可见强化的瘤组织，肿瘤已达脑表面;b.为肿瘤切除术后局部颅骨缺失(箭头)，

未见明显肿瘤残余;c.存在颅内病灶的同时，右颈部皮下出现一转移灶（箭头）

图 1 近皮层C6胶质瘤模型大鼠MRI增强扫描图像

2.3 病理学和免疫组织化学检查

肿瘤大体呈鱼肉状，无包膜。光镜下肿瘤细胞呈梭行，排列呈一定的极性，核深染。瘤组织内见丰富的新生微血管。第7、11天的肿瘤未见成片坏死，但11 d时瘤周边脑组织中可见小癌巢及散在分布的肿瘤细胞。15 d以后瘤组织内可见明显坏死，部分大鼠颅内可见较大转移灶。免疫组化在瘤组织内见散在的GFAP阳性细胞，表明肿瘤为神经源性,见图2。

2.4 流式细胞DNA细胞周期分析

G0/G1期占69.67％，S期占21.03%,G2/M期占9.30%，未见明显凋亡峰，表明肿瘤增生活跃，符合肿瘤增值动力学表现。

2.5 肿瘤对大鼠血脑屏障的影响

取荷瘤大鼠肿瘤组织、肿瘤周边2 mm处脑组织和对侧对应脑组织制成细胞悬液在荧光分光光度计上分析，在630 nm处有一明显的波峰。以肿瘤组织最明显，但距离肿瘤灶较远的对侧脑叶脑组织亦可有波峰出现。正常大鼠脑组织在630 nm处波峰不明显。

2.6 颅骨开骨窗及切除肿瘤对荷瘤鼠生存期的影响

所有22只开骨窗荷瘤鼠，无因手术死亡者。术中出血经脑棉压迫、缝合头皮后即可停止。单纯开骨窗组在18 d左右即可触及骨窗处突起的肿瘤组织，晚期突起有如“寿星头”样。开骨窗加肿瘤切除组亦最终出现上述表现，但时间较晚。对照组大鼠14 d后即可出现颅内压增高的表现。以上3组荷瘤鼠终末期都表现为精神萎靡，皮毛不整，进食减少，体质量减轻，眼睑出血淤斑, 偏瘫，部分大鼠出现肢体抽搐，最终恶液质、死亡。对照组生存期为（32.000 0±8.981 5） d，开骨窗组生存期为（41.888 9±6.461 8） d，开骨窗加肿瘤切除组生存期为（59.400 0±14.416 0） d。行单向方差分析，组间均有统计学差异。生存期两两组间比较有统计学差异。3只开骨窗取瘤组术后行头颅MRI复查未见明显肿瘤残余,见图1，但病理显示肿瘤摘除后灶周仍可见较多量肿瘤细胞浸润和小癌巢，见图2。

a.肿瘤切除后瘤腔周围“正常”脑组织内发现薄层肿瘤细胞，肿瘤向脑组织内呈树枝样浸润（HE×400）； b.为肿瘤灶周发

现的小癌巢（HE×200）；c. GFAP免疫组织化学检查示瘤组织内可见散在的GFAP呈阳性的肿瘤细胞

图2 皮下转移灶病理HE染色和GFAP免疫组织化学结果

3 讨 论

脑胶质瘤约占我国原发颅内肿瘤的45％，预后差。手术切除仍是当前治疗胶质瘤的主要方法，术后复发是患者死亡的主要原因［4］。大鼠C6胶质瘤生物学特性与人脑胶质瘤比较接近，有浸润性生长、新生血管形成的特性，具有GFAP、S100蛋白的胶质瘤特异性标志，可较好地模拟人脑胶质瘤［57］，具备建立理想胶质瘤动物模型的条件。瘤细胞易沿针道扩散是皮层种植的缺点。为提高模型的成功率，我们在接种细胞悬液中加入少量琼脂糖，注射速度控制在1 μl·min-1，注射完毕后留针5 10 min，骨蜡封闭骨窗等，确保模型的成功率和一致性。试验中为避免蛛网膜下播散，接种中心并非完全位于皮层，而是位于皮层、白质交界处，但接种第11天时肿瘤已经到达皮层表面。由于采取了以上措施，我们的颅内荷瘤鼠模型成功率达到了95％以上。 接种第11天的荷瘤鼠，颅内压增高程度尚未明显增加开骨窗的难度，且肿瘤增生活跃，可能是实验治疗的最佳时机。

由于我们所建的模型为颅内荷瘤模型，肿瘤对血脑屏障的影响亦是本实验探讨的一部分。目前大都认为5ALA很难通过正常的血脑屏障［89］。5ALA通过血脑屏障被细胞摄取后，参与一系列代谢过程，产生具有荧光效应的血卟啉衍生物IX（PPIX），根据其荧光强度即可判定血脑屏障的破坏程度［10］。本实验研究表明肿瘤对血脑屏障的破坏可能是弥漫性的。

实验中3只开骨窗取瘤大鼠瘤组织显微镜下完整切除，术后增强MRI复查未见肿瘤残余。但病理结果示瘤腔周围脑组织中仍有大量肿瘤细胞浸润甚至出现小癌巢，提示临床上恶性胶质瘤术后很快复发很可能与肿瘤切除术后灶周“正常”脑组织内的肿瘤细胞有关。

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