凋亡细胞促进狼疮性BXSB小鼠发病的研究

【摘　要】　目的　探讨凋亡细胞在系统性红斑狼疮发病中的作用。方法　将体外诱导的凋亡胸腺细胞经腹腔注射给同基因同性别的正常C57小鼠和具有狼疮倾向的雌雄BXSB小鼠；检测血清中IgM和IgG类型的抗dsDNA抗体和抗ssDNA抗体的水平，尿蛋白浓度以及肾脏中IgG类型免疫复合物的沉积。结果　用凋亡胸腺细胞免疫后，诱导C57小鼠产生IgG类型的抗dsDNA抗体和抗ssDNA抗体；相比之下，诱导雌性BXSB小鼠产生更高水平的IgG类型抗dsDNA抗体和抗ssDNA抗体；并且使雄性BXSB小鼠的尿蛋白浓度显著升高。结论　凋亡细胞具有免疫原性，它可能是狼疮性BXSB小鼠体内自身抗原的主要来源；狼疮性遗传因素和Yaa基因能促进凋亡细胞的免疫原性和增强凋亡细胞的致肾炎作用。

　　Apoptotic cells accelerate the development of systemic lupus erythematosus in lupus-prone BXSB mice

　　【Abstract】　Objective　To probe into the role of apoptotic cells in the disease development of systemic lupus erythematosus.Methods　Apoptotic thymocytes injected intraperitoneally into syngeneic normal C57 mice and lupus-prone BXSB mice,and then the level of anti-dsDNA and anti-ssDNA antibodies of IgM and IgG classes,and the concentration of urine protein and immune complex of IgG class deposited in kidney were detected.Results　The apoptotic thymocytes induced the production of anti-dsDNA and anti-ssDNA antibody of IgG class in C57 mice,and their levels were higher in female BXSB mice than in male ones.The concentration of urine protein of male BXSB mice injected with apoptotic thymocytes was noticeably higher than that of&nb sp;the control male BXSB mice.Conclusion　Apoptotic cells have immunogenicity,and may be the major source of autoantigens in lupus BXSB mice.Lupus genetic factors and Yaa gene can potentiate the immunogenicity of apoptotic cells or accelerate their inducing the lupus nephritis.

　　【Key words】　Apoptosis;　Mice,BXSB;　Lupus erythematosus,systemic

　　现在普遍认为系统性红斑狼疮(SLE)的发病机制涉及多个环节，并受遗传因素的控制和环境的影响［1］。自身抗体的产生和免疫复合物的形成是狼疮性免疫复合物型肾炎等免疫病理改变的直接原因。动物实验结果提示，狼疮性小鼠IgG类型的抗DNA抗体是自身抗原诱导的特异性体液免疫应答的结果［2］。体内的染色质(chromatin)及核小体(nucleosome)可能是主要的自身抗原［3］，但其产生来源不清楚。最近，我们实验室发现发病的狼疮性雄性BXSB小鼠的凋亡B细胞数量异常升高［4］。另有报道，在体外SLE病人的凋亡淋巴细胞也异常增加［5］。基于上述现象，我们分别将凋亡的胸腺细胞经腹腔注射给同基因(syngeneic)同性别的正常C57小鼠和处于发病之前的狼疮性遗传倾向的雌雄BXSB小鼠，人为地增加体内凋亡细胞的数量，以探讨凋亡细胞与自身抗体产生和肾炎病变的关系，以及在此过程中狼疮性遗传因素的影响。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验动物：4周龄C57小鼠，购自中国科学院遗传学研究所；4周龄雄性和雌性BXSB小鼠，由北京医科大学第三临床医学院皮肤科陈学荣教授自美国Jackson实验室引进，本室饲养繁殖。

　　1.2　凋亡细胞的诱导及收集：取同基因同性别的4周龄小鼠的胸腺细胞，用含10%FCS(hyclone)的RPMI-1640培养液配成1×107/ml浓度，加地塞米松(Dex)至10－5 mol/L浓度，在37 ℃，5%CO2的条件下，诱导细胞凋亡24 h。然后，收集胸腺细胞，用RPMI-1640培养液洗涤3次。经PI染色，用流式细胞仪检测亚二倍体细胞数作为胸腺凋亡细胞的数量。

　　1.3　免疫过程：分别将4周龄C57小鼠和雌雄BXSB小鼠随机分成两组，即实验组和对照组，每组5只小鼠。实验组每只小鼠经腹腔注射0.2 ml体积的含5×107同性别同基因的凋亡胸腺细胞。每隔10 d注射1次，共注射免疫3次。对照组每只小鼠经腹腔注射0.2 ml体积的RPMI-1640培养液，注射的次数及间隔时间同实验组。

　　1.4　免疫学检测：末次注射的10 d后，留取实验组和对照组小鼠的血清、尿液和肾脏。

　　血清作1∶50稀释，用ELISA法检测IgM和IgG类型的抗ssDNA和抗dsDNA抗体，其浓度以ELISA底物显色的A值示之。

　　用考马斯亮兰G-250液测定尿液中尿蛋白浓度［6］，作为肾炎有无或程度的指标。

　　用二乙酰单肟法测定血清中尿素氮(BUN)的浓度，作为肾功能状态的指标。试剂盒购自北京北化精细化学品公司临床诊断试剂分厂，实验方法按说明书进行。

　　留取的肾脏经冰冻切片后，用免疫荧光法［7］检测肾脏有无IgG类型免疫复合物(IC)的沉积。

　　2　结　　　果  ;

　　2.1　IgM类型抗DNA抗体的水平：胸腺细胞经10－5 mol/L Dex诱导24 h后，PI染色，用FACS检测，发现约83%细胞是亚二倍体的凋亡细胞。各个实验组小鼠与相应的对照组小鼠血清中IgM类型的抗dsDNA和抗ssDNA抗体水平差异无显著性(P＞0.05)。并且，正常C57小鼠和雌雄BXSB小鼠的血清中IgM类型的抗dsDNA和抗ssDNA抗体水平相似。

　　2.2　凋亡细胞诱导IgG类型抗DNA抗体的产生：在实验组的正常C57小鼠和雌性BXSB小鼠的血清中，IgG类型的抗dsDNA和抗ssDNA抗体水平非常显著地高于各对照组小鼠(P＜0.001)。但是，实验组雌性BXSB小鼠与对照组雌性BXSB小鼠相比，前者血清中IgG类型的抗dsDNA和抗ssDNA抗体的平均水平(A值)比后者分别增加了1.593和2.051 3；而实验组C57小鼠与对照组C57小鼠相比，前者的血清中IgG类型的抗dsDNA和抗ssDNA抗体的平均水平(A值)比后者分别增加0.685和0.898 4。显然，实验组雌性BXSB小鼠血清中IgG类型抗DNA抗体水平增加的幅度高于实验组C57小鼠。

　　此外，虽然实验组雄性BXSB小鼠血清中IgG类型的抗dsDNA和抗ssDNA抗体的平均水平高于其对照组小鼠，但增加的幅度并无显著性。

　　2.3　凋亡细胞加重雄性BXSB小鼠的狼疮肾炎：正常C57小鼠的实验组和对照组以及雌性BXSB小鼠的实验组和对照组之间尿蛋白浓度差异无显著性(P＞0.05)，并且都处于正常范围内。所有雄性BXSB小鼠的尿蛋白浓度均已高于正常范围，表明肾脏出现炎症反应。但是，雄性BXSB小鼠实验组的尿蛋白浓度比对照组的显著升高(P＜0.05)，提示凋亡胸腺细胞进一步加重了实验组雄性BXSB小鼠的肾炎病变程度。

　　免疫荧光法检测的结果显示，C57小鼠与雌性BXSB小鼠的实验组和对照组的肾脏均无IgG型IC的沉积。而雄性BXSB小鼠的实验组和对照组的肾脏均有IgG型IC的沉积。但是，由于方法的限制，未对两组小鼠肾脏IC的沉积程度作精确定量性的鉴定和区分。

　　无论是正常C57小鼠还是狼疮遗传倾向的雌雄BXSB小鼠，实验组和对照组小鼠之间的血清BUN水平差异无显著性(P＞0.05)，并且都处于正常范围内。表明凋亡细胞在诱导抗DNA抗体产生的体液免疫应答过程中，虽然加重了雄性BXSB小鼠的肾炎病变程度，但还没有达到引起肾脏功能衰竭的程度。

　　3　讨　　　论

　　BXSB小鼠是具有狼疮遗传倾向的自发性SLE小鼠模型之一［8，9］。由于Y染色体上带有Yaa基因，使得雄性BXSB小鼠的发病较雌性小鼠早且严重［8］，一般雄性鼠从2月龄开始发病，6～7个月龄时近半数死亡，而雌性小鼠在1年半时才有半数死亡［8］。因此，在本实验开始时所有BXSB小鼠的鼠龄在2个月之内，处于SLE发病的前期。此外，C57小鼠(H-2b)的MHC与BXSB小鼠(H-2b)的相同，因而以同龄C57小鼠作为正常对照。

　　实验组的C57小鼠和雌雄BXSB小鼠经凋亡胸腺细胞免疫后，IgM类型的抗dsDNA和抗ssDNA抗体水平与各自对照组小鼠的相似，表明凋亡胸腺细胞的免疫并无促进IgM类型抗DNA抗体的产生。在C57小鼠和BXSB小鼠的血清中存在着水平相近的IgM类型抗DNA抗体可能是B细胞多克隆活化的产物，一种生理性的自身抗体。

　　血清中IgG类型的抗DNA抗体的检测结果显示，经凋亡的胸腺细胞免疫后的确诱导了正常C57小鼠产生IgG类型的抗dsDNA和抗ssDNA抗体。一般认为IgG类型的抗体是胸腺依赖性抗原(TDAg)诱导的特异性免疫应答的产物，由此表明凋亡细胞在小鼠体内具有免疫原性，其可能通过释放核小体作为TDAg，在Th细胞的辅助下，刺激特异性B细胞增生和分化，产生IgG类型的抗体。本实验结果与最近Mevorach等［10］的实验报道相同。他们发现凋亡细胞具有免疫原性，可诱导正常小鼠产生IgG类型的抗核抗体等，而非凋亡细胞无此作用。至于凋亡细胞具有免疫原性的原因仍不清楚。 凋亡细胞的免疫原性明显受到遗传因素的影响。雌性BX SB小鼠经凋亡的胸腺细胞免疫后，血清中IgG类型的抗dsDNA和抗ssDNA抗体水平的增加幅度明显高于注射凋亡胸腺细胞的C57小鼠，显然狼疮性遗传因素促进了凋亡细胞的免疫原性而增加了IgG类型抗DNA抗体的产生。

　　值得注意的是带有Yaa基因的雄性BXSB小鼠经凋亡胸腺细胞免疫后，血清中IgG类型的抗dsDNA和抗ssDNA抗体的平均水平高于未经凋亡胸腺细胞注射的对照组小鼠，但经统计学处理两者并无显著差别。甚至前者还低于实验组雌性BXSB小鼠的IgG类型的抗DNA抗体的水平。但是，不能仅从凋亡细胞注射给雄性BXSB小鼠后血清中抗DNA抗体水平来判断其效果，可能它诱导产生的大量IgG类型抗DNA抗体以IC的形式沉积于肾脏中，因为免疫荧光法检测结果证实在实验组雄性BXSB小鼠肾脏中有IgG类型IC的沉积。然而其IC沉积的数量是否高于对照组雄性BXSB小鼠肾脏中沉积的IgG类型的IC未做鉴定。另外，Mohan等［3］的报道也指出用核小体免疫狼疮性遗传倾向的SNF1［(SWRxNZB)F1］小鼠后加重了肾炎病变的程度，但所有小鼠的血清中并非都有高水平的自身抗体。

　　虽然凋亡胸腺细胞诱导C57小鼠和雌性BXSB产生IgG类型的抗DNA抗体，但是尿蛋白浓度仍处于正常范围内，表明尚未引发肾脏炎症反应。在本实验中，实验组和对照组雄性BXSB小鼠的尿蛋白浓度都已有所升高，但是实验组小鼠的尿蛋白浓度显著高于对照组小鼠，表明了凋亡细胞的注射免疫进一步加重了雄性BXSB小鼠狼疮肾炎的病变程度，并且该过程显然依赖于狼疮性遗传因素和Yaa基因的存在。

　　由于凋亡细胞具有免疫原性，发病的狼疮性雄性BXSB小鼠的凋亡B细胞数量异常升高［4］，所以它们可能是自身抗原的主要来源。狼疮性遗传因素和Yaa基因的作用之一可能是促进凋亡细胞数量的增加和凋亡细胞的免疫原性以及促使IC的形成和在肾脏的沉积而加快SLE的发病过程。

　　体内凋亡细胞的数量不仅取决于生成速率，也与清除速率有关。单核巨噬细胞是清除凋亡细胞的专门细胞。因此，发病的BXSB小鼠的凋亡细胞异常升高与单核巨噬细胞功能的关系正在研究之中。

　　参 考 文 献

　　1，Kotzin BL.Systemic lupus erythematosus.Cell,1997,85:303-309.

　　2，Buringavne RW,Rubin RL,Balderas RS,et al.Genesis and evolution of antichromatin autoantibodies in murine lupus implicates T-dependent immunization with self antigen.J Clin Invest,1993,91:1687-1695.

　　3，Mohan C,Adams S,Stanik V,et al.Nuclesome:a major immunogen for pathogenic autoantibody-inducing T cells of lupus.J Exp Med,1993,177:1367-1381.

　　4，张亚东，邓鸿业，邓玉兰，等.BXSB小鼠外周B淋巴细胞凋亡的初步研究.免疫学杂志，1997，13：79-81.

　　5，Emlen W,Niebur JA,Kadera R.Accelerated in vitro apoptosis of lymphocytes from patients with systemic lupus er ythematosus.J Immunol,1994,152:3685-3692.

　　6，李影林，主编.中华医学检验全书(上册).北京：人民卫生出版社，1996.466-467.

　　7，邹万忠，主编.肾脏病理与临床.长沙：湖南科学技术出版社，1993.8-9.

　　8，Theofilopoulos AN,Dixon FJ.Murine models of systemic lupus erythematosus.Adv Immunol,1985,37:269-390.

　　9，Izui S,Iwamoto M,Fossati L,et al.Yaa gene model of systemic lupus erythematosus.Immunol Rev,1995,144:137-156.

　　10，Mevorach D,Zhou JL,Song X,et al.Systemic exposure to irradicated apoptotic cells induces autoantibody production.J Exp Med,1998,188:387-392.