临沂市两例霍乱胶体金假阳性菌株的多种方法复核及分析

临沂市两例霍乱胶体金假阳性菌株的多种方法复核及分析

季圣翔

季圣翔（临沂市疾病预防控制中心微生物检验科山东临沂276000）

【摘要】目的对两例霍乱菌株通过多种试验方法进行复核，探讨一种适用于基层的快速复核方法和步骤。方法采用镜检、血清学实验、胶体金快速检测卡、培养分纯和PCR方法进行复核，比较探讨几种方法的优缺点。结果两例送检的霍乱菌株均为阴性。结论胶体金快速检测卡阳性结果可采用动力试验、制动试验、革兰氏染色进行快速复核。

【关键词】霍乱弧菌胶体金实验复核

【中图分类号】R446.5【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）09-0107-02

霍乱弧菌（V.cholera）是引起人类霍乱的病原菌，主要通过污染的水源或餐饮食物经口传染。霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一，主要由O1和O139群霍乱弧菌所引起，曾在世界上引起多次大流行，属国际检疫传染病，也是我国传染病防治法规定的甲类传染病之一。我市基层单位对霍乱的筛查主要采取胶体金快速检测卡和玻片凝集实验的方法。2011年临沂市兰山区疾控在应用中出现两例假阳性，临沂市疾控通过多种方法对菌株进行了复核，讨论探索一种适用于基层的快速复核方法和步骤。

1材料与方法

1.1试剂培养基生产厂家为北京路桥；霍乱O1群多价诊断血清及O139群血清为兰州生物制品研究所产品；O1群霍乱弧菌检测试剂盒和O139群霍乱弧菌检测试剂盒（胶体金法）生产厂家为北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司；霍乱弧菌荧光检测试剂盒为上海申友生物技术有限责任公司产品。

1.2仪器设备7500荧光定量PCR仪（ABI,USA）、CentrifugeFRESCO17低温高速离心机（Therrmo,USA）、（ImageQuant,USA）、超纯水系统（Millipore,USA）等。

1.3方法参照WS289-2008《霍乱诊断标准》、第五版《霍乱防治手册》[1]及《全国临床检验操作规程》进行操作[2]。

1.3.1培养分纯法复检兰山区疾控送检样品均为碱性琼脂培养物和Cary-Blair半固体保存培养基。半固体先以碱性蛋白胨水（pH8.6）增菌6小时，培养液变浑浊，再使用碱性琼脂划线接种18小时后。

1.3.2镜检法复检各取疑似菌落与一滴生理盐水涂片，用革兰氏染色法将涂片进行染色，然后，用暗视野显微镜进行镜检。

1.3.3血清学实验复检平板上挑取疑似菌落接种于营养琼脂斜面置37℃纯培养24h，取斜面纯培养物进行O1群及O139群霍乱诊断血清玻片凝集试验。

1.3.4PCR方法复检对送检样品及平板菌株进行霍乱基因PCR检测，用“煮沸法”提取核酸：即取1ml增菌液加入1.5ml离心管中，4000r/min离心6min富集，去上清，加入100μlDEPC水重悬，煮沸10min，10000r/min离心2min，吸取上清液作为模板DNA,，－80℃保存备用。荧光定量PCR采用申友公司的试剂盒，反应体系为25μl，组成如下:PremixExTaq(2×)12.5μl,20μmol/L的senseprimer与antisenseprimer各0.5μl,20μmol/Lprobe0.3μl，模板DNA5μl，补DEPC水至25μl。采用ABI7500荧光检测系统按下列反应参数进行检测：94℃预变性5min，以94℃5s、59.5℃25s扩增45个循环，在59.5℃进行单点荧光检测。

1.3.5生化实验复检对这两株菌株进行下列生化实验生化试验：氧化酶试验、葡萄糖发酵试验、蔗糖发酵试验、乳糖发酵试验、麦芽糖发酵实验、L-阿拉伯糖发酵试验、O-F试验、V-P试验、硝酸盐还原试验、硫化氢试验、L-赖氨酸脱羧酶试验，L-鸟氨酸脱羧酶试验、水杨素试验、明胶液化试验以及3%Nacl、6%Nacl、8%Nacl、10%Nacl的耐盐试验。

2结果

2.1培养分纯法复检兰山区疾控送检样品的琼脂菌落形态为圆形、扁平、光滑、湿润、半透明、稍隆起，大小为1.5mm左右。在本实验室用碱性蛋白胨水（pH8.6）增菌后再用碱性琼脂划线接种培养，其菌落形态均与送检样品一致。

2.2镜检法复检疑似菌落涂片后在暗视野显微镜下可见具穿梭样动力的细菌，为动力阳性，而加入2滴O1群及O139群霍乱免疫血清后再观察，制动为阴性。革兰氏染色镜检为为革兰阴性弧形菌,无芽孢及荚膜。

2.3血清学实验复检送件样品经传代培养后进行O1群及O139群霍乱诊断血清玻片凝集试验，实验结果均为阴性。

2.4PCR方法复检对送检样品及平板菌株进行霍乱弧菌的特异基因序列进行荧光定量PCR检测，检测结果显示：样品孔3、4均为阴性，阳性对照孔5为阳性，阴性对照孔6为阴性（图1）。

图1荧光定量PCR方法检测疑似霍乱弧菌菌株

2.5生化实验复检对这两株菌株进行生化试验结果如表1所示：葡萄糖产酸产气+，氧化酶+，蔗糖－，O-F试验为发酵型，乳糖－，麦芽糖+，L-阿拉伯糖+，L-赖氨酸+，L-鸟氨酸+，水杨素－，明胶素+，硫化氢－，硝酸还原+，V-P实验－，耐盐试验微量生化管，结果在0%Nacl、10%Nacl浓度时候不生长，3%Nacl、6%Nacl及8%Nacl生长良好。生化结果与副溶血性弧菌相符，与霍乱菌生化不符。

表1霍乱疑似菌株生化试验

3讨论

霍乱作为我国甲类传染病，报告时限为2小时，因此完善一套快速、敏感、特异的检测方法，对迅速查明疫情，防止扩散，以及在对人群的流行病学调查都有重要意义。霍乱弧菌常规检测以传统培养方法为主，采用生化反应、血清学鉴定和噬菌体分型，操作繁琐、耗时长，如前增菌需6-8小时，划线分离18-24小时，分纯需18-24小时，分纯后进行血清试验，血清学诊断经常由于血清存在着非特异凝集及血清效价低下等，对诊断的准确性有干扰，得到初步结果后进行生化试验还需1天时间，整个试验过程受操作者的经验和试剂影响易出现漏检。霍乱弧菌快速检测卡是利用单克隆抗体胶体金标记技术和膜层析技术研制而成，用于定性检测样本中可能存在的霍乱弧菌O1的特异性抗原A及O139，敏感性高，直接检测需10分钟，但直接用粪便或肛拭子检测因其细菌含量较低容易造成漏检，对每份检测标本进行增菌后再用胶体金法检测，可有效地避免漏检，较好地提高检测的灵敏度，增菌后检测需时6小时，检出限为105个菌/毫升[3-4]，本次上报出现了假阳性。本次复核试验中镜检用时10分钟，制动试验用时为10分钟，霍乱基因PCR检测用时4小时左右。镜检为传统方法，但是对于细菌动力和形态鉴别有不可替代的意义，镜检可以对水样便直接进行。制动试验也是在显微镜下进行，也可对水样便直接进行。快速实时荧光定量PCR技术检测的是细菌核酸DNA，无论死菌活菌，只要存在即可被快速检出，特异、灵敏。市面上已经开发出很多荧光定量试剂盒，也出现多重PCR[5]，为霍乱弧菌的日常监测和爆发疫情的应急诊断带来便利，但也存在部分缺点，如限于硬件设施的要求，大多只适用于市级以上疾控机构的样本复核，PCR方法灵敏度高如污染易产生假阳性等。

霍乱弧菌的鉴定一定要与其他肠道传染病病原区别开来，最常见的副溶血弧菌肠炎、大肠杆菌性肠炎、鼠伤寒沙门菌感染、空肠弯曲菌肠炎、病毒性肠炎、急性细菌性痢疾和金黄色葡萄球菌所致腹泻在临床表现上各有不同，检验人员在病原检验时也应多了解患者的临床表现以作参考，流行病学调查了解的进食史、潜伏期、病程等也都是有用的参考信息。

综上所述，根据检验方法的特点提出以下建议：基层医疗机构对于霍乱弧菌胶体金快速检测卡阳性者，时间要求非常紧的情况建议可采用动力试验、制动试验、革兰氏染色的方法进行初筛复核。即霍乱弧菌胶体金快速检测卡阳性情况下取1滴急性期病人水样便分别滴在玻片上，直接镜检（暗视野或相差显微镜）可见具有流星状或穿梭样动力的细菌，为动力阳性。采水样便标本与血清比例1：1混匀，2滴便标本悬液（成形便可生理盐水稀释制成悬液）各加入2滴O1群或O139群霍乱免疫血清后，如运动停止，凝集成块，视为制动阳性[2]，同时做革兰氏染色为阴性弧菌。三种情况伴随成立可初定为阳性，送市级疾控进行复核，否则进行增菌培养后再进行快检卡、血清凝集和生化鉴定。市级疾控的快速复核可采用PCR方法和传统方法同时进行。PCR方法结果阳性进行初步证实，再利用传统方法对菌株进行血清分型、生化分型和（或）噬菌体分型。

参考文献

[1]中华人民共和国卫生部疾病预防控制司，霍乱防治手册[M](第5版).北京：人民卫生出版社,1999:31-91.

[2]叶应妩,王毓三,申子瑜,等.全国临床检验操作规程[M](第3版).南京：东南大学出版社,2006：822-825.

[3]谢昭聪,宋志强,吕敬章,等.应用胶体金免疫层析法检测水产品中霍乱弧菌的研究[J].中国国境卫生检疫杂志,2005,28(3):163-165.

[4]李少彤,栾玉明,郭钜旋,等.胶体金法快速检测霍乱弧菌诊断试验的研究设计与分析[J].中国卫生检验杂志,2006,16(3):269-271.

[5]井良义,陈锦英,王书梅,等.多重PCR检测霍乱弧菌RTX毒力基因[J].中国卫生检验杂志,2005,15(9):1039-1041.