干细胞移植治疗肝硬化的现状及展望

干细胞移植治疗肝硬化的现状及展望

黄朝刚刘保池(通讯作者)

黄朝刚刘保池(通讯作者)

(上海市<复旦大学附属>公共卫生临床中心外科201508)

【摘要】肝硬化是严重威胁人类健康的疾病之一,目前对于肝硬化尚缺乏有效的治疗措施,对于终末期肝病，肝移植是最有效的根治方法，但由于种种条件的限制,如供肝的缺乏、手术创伤大、免疫排斥、昂贵的费用等阻碍了其在临床的广泛开展。干细胞移植治疗肝硬化正在成为一种损伤小、并发症少、疗效明显的治疗手段。本文就干细胞的生物学特性及其在治疗肝硬化方面的作用进行综述。

【中图分类号】R657.3+1【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）03-0048-03

1.引言

肝硬化(livercirrhosis,LC)是一种由多种病因引起的慢性肝病，以肝细胞广泛变性坏死，纤维组织弥漫性增生，再生结节形成导致肝小叶结构破坏和假小叶形成，使肝脏逐渐变形、变硬为特征的疾病。临床上有多系统受累，以肝功能损害和门脉高压为主要表现，晚期常出现上消化道出血、肝性脑病、感染等多种并发症。肝细胞移植曾一度被认为是很有希望的疗法，但大量研究表明移植后的肝细胞在体内存活和增殖十分困难，临床实用价值不大[1]。原发病的治疗(如抗病毒治疗、戒酒、纠正代谢或免疫功能紊乱等)虽是肝纤维化治疗的重要步骤，但并不能替代抗纤维化治疗，临床和实验研究均证实，许多肝脏疾病在病因去除后，相当一部分肝纤维化仍继续发展为肝硬化[2]。因此，寻求和探索一种新的肝硬化治疗技术成为了人们努力的方向。

2000年，日本学者Alison、Theise、Korbling等研究证实间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)具有向肝实质细胞分化的潜能[3-5]。MSCs是一类具有自我增殖和多向分化潜能的多能干细胞。大量研究表明MSCs能向多种细胞分化，具有强大的可塑性。在一定的微环境中MSCs可被诱导分化为肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞等[6-9]。已经在骨髓[10]、脐血[11]、脂肪[12]、皮肤[13]等许多组织中分离出了MSCs,，且普遍认为骨髓是其最主要的来源。

2.肝纤维化及肝硬化的损伤与修复机制

正常情况下，肝脏的实质细胞和细胞外基质保持着动态平衡，并且实质细胞形成特定的空间结构——正常的肝小叶结构，从而保证肝脏的各种生理功能。肝脏受损后，典型的修复过程包括两个方面:一方面是肝细胞再生，即新生的肝细胞替代受损、坏死的肝细胞发挥作用。新生肝细胞来源包括[14]:(1)成熟肝细胞，通过有限的有丝分裂补充肝细胞的数量，其增殖能力及修复作用有限；(2)肝前体细胞（肝卵圆细胞、肝干细胞），肝脏受损时可定向增殖分化为肝细胞或胆管上皮细胞参与肝脏修复，能起到一定的代偿修复作用，但肝内所含数量有限，在增殖分化能力上弱于多能干细胞；(3)非肝源性多能干细胞，如骨髓干细胞、骨髓MSCs、脐血MSCs等，此类细胞具有强大的增殖分化能力，在肝损害的微环境下可以增殖分化出较多的肝细胞，因此是理想的肝脏修复细胞来源[15]。另一方面则是纤维组织增生，纤维结缔组织代替了肝正常的实质组织，肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)是形成肝纤维化的最主要细胞，肝细胞受到各种损伤因子的作用释放各种炎症因子及细胞因子等，通过信号转导促进HSCs的激活、增殖及转化，合成大量的细胞外基质（extracellularmatrix,ECM），同时合成和释放大量基质金属蛋白酶抑制因子(tissueinhibitorofmetalloproteinases,TIMPs),使间质胶原酶等蛋白酶活性降低,ECM降解减少,这些代偿尽管初期是有益的，但若持续进行，最终导致ECM过度积聚而发生肝纤维化乃至肝硬化[16]。因此，阻断或逆转肝纤维化发展进程及促进肝细胞再生是治疗的主要方面。

3.干细胞移植为LC的治疗提供了新的手段

3.1基础研究：干细胞作为一种具有横向分化能力的多能干细胞，近年来大量研究表明在合适的培养条件下其在体内外均可以向肝细胞分化。2000年，日本学者Oh等[17]使用大鼠骨髓干细胞，加入不同浓度的HGF（干细胞生长因子）进行体外诱导培养之后检测到了鼠源性CK18、CK8、AFP等肝细胞特异性标志，发现了骨髓干细胞可以分化为肝样细胞；2002年,Danet等[18]经过体外实验证实脐血干细胞也是可以向肝细胞分化的。为了证明骨髓细胞是否可用于修复肝损伤，2003年日本学者Terai[19]等建立了GFP（绿色荧光蛋白）/CCl4小鼠模型，在这个模型中，C57BL/6小鼠通过腹腔注射CCl4而诱导成肝硬化模型，从来自同一品系的绿色荧光蛋白转基因小鼠（GFP-Tg小鼠，即C57BL6/Tg14[act-EGFP]OsbY01小鼠）上获取GFP+_BMC，GFP+_BMC通过尾静脉注入肝硬化小鼠组和对照组（无肝损伤），通过免疫荧光染色证实，GFP+_BMC能有效地迁移到受损肝脏，首先分化为肝母细胞，在进一步分化为能生成白蛋白的肝细胞，然而在对照组肝组织中并没有发现GFP+_BMC，上述结果说明了GFP/CCl4小鼠模型可用于理解BMC分化为肝细胞的过程，进一步说明了持续性肝损伤、炎症是骨髓干细胞分化为肝细胞的微环境和必要条件。

3.2骨髓干细胞或间充质干细胞对肝纤维化的治疗作用：如前所述，在GFP/CCl4小鼠模型中，输注的BMC分化成能生成白蛋白的肝细胞，从而提高了血浆白蛋白的水平。Sakaida、Terai[20]等人也报道了BMC输注能改善肝纤维化，输注的BMC在肝脏沿纤维条索迁移，并高表达基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMP）2、9和14，特别是MMP-9的高表达，从而降解过多沉积的细胞外基质，因此提高了小鼠的生存率。输注的BMC除了分化为肝细胞外，一部BMC明显表达MMP-9。然而，Russoetal[21]报道了BMC也能分化成能加重肝纤维化的肝星状细胞，如此矛盾的结果可能源自试验条件的不同。因此进一步研究那些能影响BMC向实质细胞还是向非实质细胞分化的因素或因子就显得很重要。

3.3骨髓干细胞类型：根据已有的研究，骨髓中主要包括以下三类细胞：造血干细胞（hematopoieticstemcells，HSC）、间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSC）和其他细胞。2004年Yamamoto、Terai等人[22]确定了BMC中的间充质干细胞主要负责肝功能的改善和肝纤维化的消退。间充质干细胞不仅能分化为肝细胞，而且在体内具有免疫调节的功能[23]。间充质干细胞也能通过间充质干细胞来源的IL-10和TNF-α直接抑制肝星状细胞，也可部分通过Fas/FasL通路诱导肝星状细胞凋亡，从而减少细胞外基质的沉积。

3.4临床应用研究：干细胞移植在肝病治疗方面的临床研究证实，经干细胞治疗后的患者,其临床一般情况好转，肝功能改善。国内曹葆强、许瑞云[24]等对40例肝硬化门静脉高压症患者的研究表明，自体骨髓细胞经门静脉回输治疗组患者的肝功能和肝纤维化血清学指标有明显改善且无明显不良反应，证实了干细胞移植治疗的可行性。王福生等[25]分析了45例慢性乙肝失代偿性LC患者，其中30例患者接受脐带来源间充质干细胞（UC-MSC）经外周静脉输注治疗，15例患者接受生理盐水作为对照组，随访1年后结果显示治疗组腹腔积液明显减少，肝功能显著改善，MELDNa评分明显减少。王福生等[26]也报道了用UC-MSC治疗7例对熊去氧胆酸治疗欠佳的原发性胆汁性肝硬化患者，随访2年后结果显示患者体力好转、皮肤瘙痒明显减轻，血清碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转移酶水平较治疗前明显下降，提示UC-MSC治疗可能抑制自身抗原诱导的免疫反应和帮组损伤胆管的修复。术后均未发现严重不良反应,提示干细胞移植安全可行，可不同程度改善肝功能。Terai等[27]报道了9例肝硬化失代偿期患者经外周静脉骨髓干细胞移植的临床疗效，随访1年后血清白蛋白、总蛋白显著提高，Child-Pugh评分显著减少，并且肝组织活检提示AFP、PCNA（增殖细胞核抗原）显著升高，说明有新的肝细胞生成。刘保池等[28]报道了4例艾滋病合并失代偿性肝硬化患者经门静脉自体骨髓细胞回输治疗的疗效，其中3例病人随访了2年，1例随访了3个月，结果显示除了白蛋白的恢复、腹水的减少、Child-Pugh评分显著减少外，惊奇地发现移植术后1月，外周血CD4+T淋巴细胞数在每个患者中开始增加，这种增加趋势在随访期间一直保持着，明显有别与仅接受抗逆转录病毒治疗的艾滋病患者，这可能提示了一个艾滋病治疗的新的辅助手段。上述研究报道虽然存在纳入病例数较少，暂无法长期追踪观察进行疗效评价等局限性，但是初步临床疗效是积极肯定的，这均表明干细胞移植不失为治疗肝硬化、终末期肝病的另一种有效治疗选择。

4.干细胞的移植途径

移植途径的选择可能会直接影响到移植细胞在肝脏的定植量，进而影响治疗效果，临床上细胞的移植途径主要包括介入方法行肝动脉输入、门静脉移植、直接注入肝内、外周静脉移植、腹膜腔移植等。

4.1经股动脉介入移植:在X线监视下，股动脉穿刺插管至肝动脉，将制备好的骨髓干细胞、或MSCs沿导管从肝动脉缓慢注入，由于介入技术广泛开展，在临床上开展也较多，但肝动脉的压力高和快速血流使BMC在肝内定植困难，此外，其复杂的操作和昂贵的费用也使许多人望而却步。

4.2门静脉移植:门静脉血液中含有丰富的营养成分，移植的细胞经血流到达肝血窦后，可缓慢向肝索迁移，并在肝脏炎症损伤所释放的细胞因子诱导下在肝内定植，重复的门静脉移植可增加细胞在肝内定植数，起到更好的治疗效果，相比外周血更具有优势[29]。但肝硬化时如果门脉压显著增高，移植的细胞可随侧支循环较多分散到其他部位，从而减少到达肝脏的细胞。

4.3直接注入肝内:由于具有出血倾向，以及移植的细胞可能直接进入中央静脉而使产生肺栓塞的风险增加，局部注射无法解决肝脏弥漫性病变的问题，疗效极为有限，故临床上很少开展。

4.4外周静脉移植：此方法最简单省事，但移植的细胞是否会因在全身的分散定植、肺脏的巨噬细胞吞噬等而导致最终到肝脏归巢细胞数量不足，影响对肝硬化的治疗效果。

4.5腹膜腔移植：腹腔移植简单，但所需细胞量大，可能导致腹腔内粘连，移植的细胞难直接进入受损肝脏，且在腹腔内存活时间不长。

5.结论

5.1目前对于移植的骨髓干细胞或MSCs发挥治疗作用的具体机制有了初步的了解，机制可能包括:(1)直接分化：在肝脏损伤微环境的影响下定植、增殖，并分化成为肝细胞发挥作用；(2)旁分泌途径:在肝损伤环境中MSCs可以分泌不同水平的细胞因子相互影响，表现出抗炎症反应的作用，并可能激活肝内的肝干细胞，促进肝细胞再生[30]；(3)细胞融合:MSCs可能直接与肝细胞融合，进而启动细胞的增殖过程[31-32]；(4)抑制产生细胞外基质的HSC的活化，并促进HSC的凋亡[33]；(5)MSCs通过高表达基质金属蛋白酶降解ECM，直接降解肝内过量沉积的ECM，减轻肝纤维化[22]；(6)激活肝内残存肝细胞、Kuppffer细胞，在一定程度上启动内源性肝细胞增殖过程和Kuppffer细胞分泌MMP降解ECM等；（7）间充质干细胞不仅能分化为肝细胞，而且在体内具有免疫调节的功能[23]，减轻肝脏炎症反应和损伤。

5.2干细胞自身的独特优势和其在基础及临床上的研究进展，BMC治疗肝纤维化和肝功能不全已初显端倪，显示出了一定的临床应用前景，但仍然有许多问题没有解决。首先，BMC以什么样的形式输注效果最好?是全骨髓细胞或MSCs，是否经体外培养扩增或经体外诱导分化？其次，BMC移植的最佳数量级、最佳移植次数、最佳移植周期、最佳移植时机、最佳移植途径等没达成统一的执行标准；最后，BMC向肝细胞分化是如何调控的?能否找到更多的促进或加速BMC向肝实质细胞分化并增强其抗肝纤维化疗效的细胞因子或药物?如已发现的FGF2。移植细胞的归巢定植的具体机制、远期疗效及安全性的评价等都是需要继续努力的方向。虽然目前很多治疗手段都只限于动物试验和细胞水平，从实验室到临床仍有很长的路要走，但是随着基因干预、靶向治疗、干细胞移植等手段的丰富及发展，人人类攻克肝硬化这一难题的前景将是光明的。

参考文献

[1]MalhiH，GuptaS．Hepatocytetranspantation：newhorizonsandchallenges．JHepatobiliaryPranceatSurg，200l，8：40-50．

[2]漆德芳．肝硬化．北京：北京科学技术出版社，2000：85．90．

[3]AlisonMR,PoulsomR,JefferyRetal.Hepatocytesfromnon-hepaticadultstemcells.Nature2000;406:257.

[4]TheiseND,NimmakayaluM,GardnerRetal.Liverfrombonemarrowinhumans.Hepatology2000;32:11–16.

[5]KorblingM,KatzRL,KhannaAetal.Hepatocytesandepithelialcellsofdonororigininrecipientsofperipheral-bloodstemcells.N.Engl.J.Med.2000;346:738–46.

[6]PittengerMF,MackayAM,BeckSC,JaiswalRK,DouglasR,MoscaJD,MoormanMA,SimonettiDW,CraigS,MarshakDR.Multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells.Science1999;284:143-147[PMID:10102814DOI:10.1126/science.284.5411.143].

[7]GangEJ,HongSH,JeongJA,HwangSH,KimSW,YangIH,AhnC,HanH,KimH.Invitromesengenicpotentialofhumanumbilicalcordblood-derivedmesenchymalstemcells.BiochemBiophysResCommun2004;321:102-108[PMID:15358221DOI:10.1016/j.bbrc.2004.06.111].

[8]LeeOK,KuoTK,ChenWM,LeeKD,HsiehSL,ChenTH.Isolationofmultipotentmesenchymalstemcellsfromumbilicalcordblood.Blood2004;103:1669-1675[PMID:14576065DOI:10.1182/blood-2003-05-1670].

[9]GangEJ,JeongJA,HongSH,HwangSH,KimSW,YangIH,AhnC,HanH,KimH.Skeletalmyogenicdifferentiationofmesenchymalstemcellsisolatedfromhumanumbilicalcordblood.StemCells2004;22:617-624[PMID:15277707DOI:10.1634/stem-cells.22-4-617].

[10]KramperaM,MarconiS,PasiniA,GalièM,RigottiG,MosnaF,TinelliM,LovatoL,AnghileriE,An-dreiniA,PizzoloG,SbarbatiA,BonettiB.Inductionofneural-likedifferentiationinhumanmesen-chymalstemcellsderivedfrombonemarrow,fat,spleenandthymus.Bone2007;40:382-390[PMID:17049329DOI:10.1016/j.bone.2006.09.006].

[11]EricesA,CongetP,MinguellJJ.Mesenchymalpro-genitorcellsinhumanumbilicalcordblood.BrJHaematol2000;109:235-242[PMID:10848804DOI:10.1046/j.1365-2141.2000.01986.x].

[12]HoogduijnMJ,CropMJ,PeetersAM,VanOschGJ,BalkAH,IjzermansJN,WeimarW,BaanCC.Humanheart,spleen,andperirenalfat-derivedmesenchymalstemcellshaveimmunomodulatorycapacities.StemCellsDev2007;16:597-604[PMID:17784833DOI:10.1089/scd.2006.0110].

[13]BernardBA.[Humanskinstemcells].JSocBiol2008;202:3-6[PMID:18460303DOI:10.1051/jbio:].

[14]廖金卯,胡小宣.脐血间充质干细胞移植治疗肝硬化的研究进展[J].世界华人消化杂志,2013(06):508-513.

[15]SellS.Heterogeneityandplasticityofhepatocytelineagecells.Hepatology2001;33:738-750[PMID:11230756DOI:10.1053/jhep.2001.21900].

[16]SafadiR,FriedmanSL.Hepaticfibrosisroleofhepaticstellatecellactivation[J].MedGenMed,2002,4:27-30.

[17]OhSH,MiyazakiM,KouchiH,InoueY,Sakagu-chiM,TsujiT,ShimaN,HigashioK,NambaM.Hepatocytegrowthfactorinducesdifferentiationofadultratbonemarrowcellsintoahepatocytelineageinvitro.BiochemBiophysResCommun2000;279:500-504[PMID:11118315DOI:10.1006/bbrc.2000.3985].

[18]DanetGH,LuongoJL,ButlerG,LuMM,TennerAJ,SimonMC,BonnetDA.C1qRpdefinesanewhumanstemcellpopulationwithhematopoieticandhepaticpotential.ProcNatlAcadSciUSA2002;99:10441-10445[PMID:12140365DOI:10.1073/pnas.162104799].

[19]TeraiS,SakaidaI,YamamotoNetal.Aninvivomodelformonitoringtrans-differentiationofbonemarrowcellsintofunctionalhepatocytes.J.Biochem.2003;134:551–8.

[20]SakaidaI,TeraiS,YamamotoN,OkitaK.TransplantationofbonemarrowcellreversesCCl4-inducedliverfibrosis.Hepatology2002;36:295A.

[21]RussoFP,AlisonMR,BiggerBWetal.Thebonemarrowfunctionallycontributestoliverfibrosis.Gastroenterology2006;130:1807–21.

[22]YamamotoN,TeraiS,OhataSetal.Asubpopulationofbonemarrowcellsdepletedbyanovelantibody,anti-Liv8,isusefulforcelltherapytorepairdamagedliver.Biochem.Biophys.Res.Commun.2004;313:1110–18.

[23]UccelliA,MorettaL,PistoiaVMesenchymalstemcellsinhealthanddisease.NatRevImmunol2008;8:726–736.

[24]曹葆强,林继宗,钟跃思,等.自体骨髓细胞经门静脉移植治疗肝硬化与肝功能不全的临床研究[J].中华普通外科杂志,2007,22(5):386-389.

[25]ZhangZ,LinH,ShiM,etal.Humanumbilicalcordmesenchymalstemcellsimproveliverfunctionandascitesindecompensatedlivercirrhosispatients[J].JGastroenterolHepatol,2012,27Suppl2:112-120.

[26]WangL,LiJ,LiuH,etal.Apilotstudyofumbilicalcord-derivedmesenchymalstemcelltransfusioninpatientswithprimarybiliarycirrhosis[J].JGastroenterolHepatol,2013,28Suppl1:85-92.

[27]TeraiS,IshikawaT,OmoriKetal.Improvedliverfunctioninpatientswithlivercirrhosisafterautologousbonemarrowcellinfusiontherapy.StemCells2006;24:2292–8.

[28]BLiu,XChen,YWang,YShi.CurativeeffectofhepaticportalvenousadministrationofautologousbonemarrowinAIDSpatientswithdecompensatedlivercirrhosis.CellDeathandDisease(2013)4,e739;doi:10.1038/cddis.2013.261.

[29]HagaJ,WakabayashiG,ShimazuM,TanabeM,TakaharaT,AzumaT,SatoY,HakamataY,Ko-bayashiE,KitajimaM.Invivovisualizationandportallyrepeatedtransplantationofbonemar-rowcellsinratswithliverdamage.StemCellsDev2007;16:319-328[PMID:17521242DOI:10.1089/scd.2006.0086].

[30]ParekkadanB,vanPollD,SuganumaK,CarterEA,BerthiaumeF,TillesAW,YarmushML.Mesenchymalstemcell-derivedmoleculesreversefulminanthepaticfailure.PLoSOne2007;2:e941[PMID:17895982DOI:10.1371/journal.pone.0000941].

[31]CamargoFD,FinegoldM,GoodellMA(2004)Hematopoieticmyelomonocyticcellsarethemajorsourceofhepatocytefusionpartners.JClinInvest113:1266–1270.

[32]WillenbringH,BaileyAS,FosterM,AkkariY,DorrellC,OlsonS,FinegoldM,FlemingWH,GrompeM(2004)Myelomonocyticcellsaresufficientfortherapeuticcellfusioninliver.NatMed10:744–748.

[33]AkiyamaK,ChenC,WangD,XuX,QuC,YamazaT,etal.MesenchymalstemcellinducedimmunoregulationinvolvesFAS-ligand-/FAS-mediatedTcellapoptosis.CellStemCell2012;10:544–555.