细胞化学染色检验

细胞化学染色检验

付振艳孙彦平王英辉杨金玉

付振艳孙彦平王英辉杨金玉(黑龙江省鸡西矿业集团总医院158100)

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2010）34-0249-02

【摘要】细胞化学染色是细胞学和化学相结合而形成的一门科学。它以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种化学物质(酶类、脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等)作定性、定位、半定量分析的方法。

【关键词】血液细胞染色检验

过氧化物酶(peroxidase，POX)染色方法有Washburn法、四甲基联苯胺法和改良的Pereira染色法等。前者曾是最为常用的方法，但由于其底物联苯胺具有致癌性，故现常用后两者，下面分别介绍这两种方法的原理。

四甲基联苯胺法粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶，POX能分解H2O2而释放出新生氧，使四甲基联苯胺氧化成联苯胺蓝，后者与亚硝基铁氰化钠结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色物质，沉淀于酶活性的细胞质内。

改良的Pereira染色法粒细胞和部分单核细胞中POX能分解H2O2而释放出新生氧，使碘化钾氧化生成碘，碘再与煌焦油蓝作用形成蓝绿色沉淀，定位于酶活性的细胞质内。

1苏丹黑染色原理

苏丹黑B(SudanblackB，SBB)是一种脂溶性重氮染料，能溶解于细胞内的含脂结构(如中性脂肪、磷脂、糖脂和类固醇)中，而使脂类物质显示出来，呈棕黑色或深黑色。脂类物质在粒细胞中丰富，单核细胞中也有少量。

2中性粒细胞碱性磷酸酶染色原理

中性粒细胞碱性磷酸酶(neutrophilicalkalinephosphatase，NAP)染色的方法有G0mori钙-钴法和Kaplow偶氮偶联法，因为钙-钴法操作较为繁琐且所需时间长，而偶氮偶联法的试剂盒操作方便，染色时间短，故目前国内常用偶氮偶联法。

Kaplow偶氮偶联法成熟中性粒细胞碱性磷酸酶在pH9.6左右的碱性环境中，能水解基质液中的磷酸萘酚钠底物，释放出萘酚，后者与重氮盐偶联，生成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质酶活性所在之处。不同的底物与重氮盐的组合不同，化学反应过程以α-醋酸萘酚钠为例。

3酸性磷酸酶染色原理

酸性磷酶(acidphosphatase，ACP)存在于细胞的溶酶体颗粒中，有的细胞中酸性磷酸酶耐酒石酸，故抗酒石酸酸性磷酸酶染色有助于某些疾病的诊断及鉴别诊断。染色方法有偶氮偶联法和Gomori硫化铅法，以前者为常用，下面介绍两种方法的原理。

偶氮偶联法血细胞内的酸性磷酸酶在酸性(pH5.0)条件下水解基质液中的磷酸萘酚As-BI，释放出萘酚AS-BI，后者与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为六偶氮付品红，形成红色的沉淀。

4抗酒石酸酸性磷酸酶染色

用相同方法制备两份基质液，一份加入适量的L-酒石酸(tanaricacid).另一份不加酒石酸。取两张相同标本的涂片，分别用这两种不同的基质液作酸性磷酸酶染色。如果血细胞内的酸性磷酸酶耐L-酒石酸，两张均呈阳。如不耐L-酒石酸，不加L-酒石酸者呈阳性反应，而加L-酒石酸者呈阴性反应。

5过碘酸-雪夫反应原理

过碘酸是氧化剂，使含有乙二醇基(-CHOH-CHOH)的多糖类物质(糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白及糖脂等)氧化，形成双醛基(-CHO-CHO)。醛基与雪夫孽型中的无色品红结合，使无色的品红变成紫红色化合物，定位于含有多糖类的细胞内。过碘酸-雪夫反应(periodicacid-Schiffreaction，PAS)以前又称为糖原染色。

6氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色原理

血细胞内的氯乙酸AS-D萘酚酯酶(naphytholAS-Dchloroacetateesterase，AS-DNCE)水解基质液中的氯乙酸AS-D萘酚，产生AS-D萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC，形成的有色沉淀为红色。NAS-DCE几乎仅出现在粒细胞、其特异性高，因此又称为“粒细胞酯酶”、“特异性酯酶”。

α-醋酸萘酚酯酶染色

[原理]血细胞内的α-醋酸萘酚酯酶(α-naphythyolacetateesterase,α-NAE)在pH中性的条件下水解基质液中的α-醋酸萘酚，释放出α-萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢蓝B，形成的有色沉淀为棕黑色或灰黑色。α-NAE存在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，故它是一种中性非特异性的酯酶。单核系细胞的阳性可被氟化钠抑制，所以作α-NAE染色时，通常同时作氟化钠抑制试验。

7醋酸AS-D萘酚酯酶染色原理

血细胞内的醋酸As-D萘酚酯酶(naphythyolAS-Dacetateesterase，AS-DNAE)在pH中性的条件下水解基质液醋酸AS-D萘酚，释放出AS-D萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢蓝BB，形成的有色沉淀为蓝色。α-NAE存在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，故它是一种中性非特异性的酯酶。单核系细胞的阳性可被氟化钠抑制，所以作NAS-DAE染色时，通常同时作氟化钠抑制试验。

8α-丁酸萘酚酯酶染色原理

血细胞内的α-丁酸萘酚酯酶(α-naphythyolbutyrateesterase，α-NBE)在pH碱性的条件下水解基质液中的α-丁酸萘酚，释放出α-萘酚，后者与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC，形成的有色沉淀为红色。α-NBE主要存在于单核细胞中，其阳性产物能被氟化钠抑制，而其他细胞系列的阳性产物不能被氟化钠抑制。

9酸性α-醋酸萘酚酯酶染色原理

血细胞中的酸性仅.醋酸萘酚酯酶(acidα-naphythyolacetateesterase，ANAE)在pH弱酸性(pH5.8)的条件下，水解基质液中的仅.醋酸萘酚，产生α-萘酚，萘酚再与六偶氮付品红形成红色沉淀，定位于胞质中酶活性处。

10酯酶双染色

在同一张涂片上进行两种酯酶染色的方法称为酯酶双染色。一般采用一种特异性酯酶加一种非特异性酯酶染色，故常用的有Ⅸ。醋酸萘酚酯酶与氯乙酸AS-D萘酚酯酶双染色、α-丁酸萘酚酯酶与氯乙酸AS-D萘酚酯酶双染色等。反应的原理基本上同各自的染色原理，但同一张涂片上的血细胞要分别在两种不同的基质液中作用一定时间，最后复染、显微镜观察。酯酶双染色对诊断急性粒-单细胞白血病的诊断具有独特的价值，即在同一张片中出现两种酯酶染色阳性的细胞或同一种细胞同时出现两种酯酶染色阳性结果。

11铁染色原理

正常人骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中。骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。

参考文献

[1]张曦.人脐血基质细胞生物学特点及其体外扩增的研究[D]第三军医大学,2003.

[2]程文康.人凝血酶及纤维蛋白原的制备[D]西北大学,2003.

[3]高蕾.VCAM-1修饰人脐血基质细胞对造血干/祖细胞扩增的实验研究[D]第三军医大学,2005.

[4]林茂芳,宋菊贞,林修基,沈洁,郁知非.成人急性白血病细胞类型及细胞化学染色的研究[J].浙江医科大学学报,1982,(S1).