一测多评法测定妇乐颗粒中5种指标成分的含量

一测多评法测定妇乐颗粒中5种指标成分的含量

胡康李敏姚青毕宇安

（江苏康缘药业股份有限公司江苏连云港222000）

【摘要】目的：建立一测多评（QAMS)法测定妇乐颗粒中5种蒽醌类成分含量的分析方法，并与外标法进行比较，评价QAMS法用于妇乐颗粒质量控制的方法适用性。方法：以妇乐颗粒为研究对象，建立芦荟大黄素（AloeEmodin）、大黄酸（Rhein）、大黄酚(Chrysophanol)和大黄素甲醚(Rheochrysidin)4种指标成分与内参物大黄素（Emodin）的相对校正因子，并通过对比外标法的测定结果以证明该方法的适用性。结果：通过对比可知，采用QAMS法测定的结果与外标法无显著性差异。结论：QAMS法可以作为一种简便准确的质量控制方法用于妇乐颗粒中5种蒽醌类指标成分的含量测定。

【关键词】妇乐颗粒；一测多评；相对校正因子；高效液相色谱；大黄蒽醌

【中图分类号】R286【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）24-0359-03

妇乐颗粒处方由忍冬藤、甘草、蒲公英、赤芍、醋延胡索、大血藤、大青叶、牡丹皮、川楝子、熟大黄组成，功能主治为清热凉血，化瘀止痛。用于瘀热蕴结所致的带下病，症见带下量多、色黄，少腹疼痛；慢性盆腔炎见上述证候者[1]；方中熟大黄是发挥药理作用的重要组成部分，而大黄蒽醌类是熟大黄的主要成分，妇乐颗粒现执行标准为《中国药典》2015年版，其对蒽醌类成分的控制主要为外标法测定大黄素和大黄酚，而并没有对其他3种成分进行测定，同时由于多指标含量测定时需同时配制对应的对照品，成本高且对照品采购困难，易延误检测。基于以上原因，参考现有检测方法，可知采用QAMS法可以通过选用一个对照品做内参物同时测定多指标成分的含量[2]，提高了检验效率和降低了实验成本。本研究以妇乐颗粒为研究对象，以相对误差为指标比较外标法和QAMS法测定结果的差异性，并评价QAMS法测定妇乐颗粒中指标成分的可行性。

1.仪器与材料

Agilent1100高效液相色谱仪；Agilent1200高效液相色谱仪；岛津UV-2401PC紫外分光光度计。色谱柱：KromasilC18（250mm×4.6mm，5μm），PhenomenexlunaC18（250mm×4.6mm，5μm），HypersilODS-2C18(250mm×4.6mm，5μm)。

芦荟大黄素（AloeEmodin）、大黄酸（Rhein）、大黄素（Emodin）、大黄酚(Chrysophanol)和大黄素甲醚(Rheochrysidin)均来源于中检院，妇乐颗粒供试品（来源于市售4个厂家共11个批次），乙腈、甲醇均为色谱纯，试验用水为自制超纯水，其余化学试剂均为分析纯。

2.方法与结果

2.1方法和方法学考察

2.1.1色谱条件及系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%磷酸（80:20）为流动相，流速1.0ml/min，柱温30℃，波长254nm。样品理论板数按内参物大黄素计应不低于5000[3]。色谱图见图1。

1：芦荟大黄素（AloeEmodin）2：大黄酸（Rhein）3：大黄素（Emodin）4：大黄酚(Chrysophanol)5：大黄素甲醚(Rheochrysidin)

图1对照品和供试品的HPLC色谱图

2.1.2混合对照品溶液制备

精密称取上述5种对照品适量，加甲醇溶解并分别制成每1ml各含芦荟大黄素30ug、大黄酸30ug、大黄素30ug、大黄酚30ug、大黄素甲醚10ug的混合对照品储备液，备用。

2.1.3供试品溶液的制备

取装量差异项下的本品，研细，取约0.3g，精密称定，置烧瓶中，加8%盐酸溶液10ml，超声处理3分钟，再加入25ml三氯甲烷[4]，水浴中回流提取1小时，放冷，将溶液转移至150ml分液漏斗中，洗涤容器，待溶液振摇分层后，分取三氯甲烷液，酸液继续用三氯甲烷振摇提取3次，每次10ml，合并后减压回收三氯甲烷至干，加甲醇适量并转移至5ml量瓶中，加甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4阴性对照溶液的制备

按照妇乐颗粒的处方工艺制备缺熟大黄的阴性样品，按2.1.3项下方法制备缺熟大黄的阴性对照溶液。由图1可知，阴性对照不干扰5种成分的含量测定。

2.1.5线性关系考察

取混合对照品储备液（AloeEmodin28.42ug/ml、Rhein30.17ug/ml、Emodin31.29ug/ml、Chrysophanol30.25ug/ml、Rheochrysidin9.86ug/ml）1ml、2ml、4ml、8ml、15ml分别至20ml量瓶中，制成系列浓度的对照品测试溶液，在上述色谱条件下分别进样分析。以各对照溶液浓度(ug/ml)为横坐标(X)，以对照品峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，结果表明5种成分在以下范围内，绘制的标准曲线呈良好线性关系。结果见表1。

2.1.6精密度试验

取同一批次的妇乐颗粒供试品溶液（批号151102），连续进样6次，记录峰面积，结果上述5种指标成分的峰面积RSD分别为0.41%、0.35%、0.44%、0.39%、1.21%、，表明在此条件下仪器进样精密度良好。

2.1.7稳定性试验

取同一批次的妇乐颗粒供试品溶液（批号151102），分别在放置0、2、6、10、12、18、24h时进样，测定样品峰面积，计算RSD。结果妇乐颗粒中5种指标成分的RSD值均小于2%，表明该方法在24h内，供试品溶液的稳定性良好。

2.1.8加样回收率试验

取已知含量的妇乐颗粒供试品溶液0.15g，共6份，分别按照1:1的比例加入一定量的混合对照品溶液，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，根据加样回收率计算公式计算各成分的加样回收率及RSD。结果妇乐颗粒中5种指标成分的加样回收率均大于95%，RSD分别为0.7%、0.4%、0.7%、1.3%、1.5%，表明该方法准确度良好。

2.1.9定量限试验

取线性关系考察中最低浓度对照品溶液进行稀释，按信噪比为10：1时的溶液浓度计算定量限。经计算可知，上述各指标成分的定量限分别为0.06ug/ml、0.42ug/ml、0.93ug/ml、0.04ug/ml和0.24ug/ml。

2.2相对校正因子f的确定和验证

2.2.1各成分相对校正因子的测定

取2.1.5项下系列浓度的混合对照品测试溶液，按上述色谱条件，分别进样2次，计算各成分的f值[5]。测定结果见表2。

2.2.2不同因素对相对校正因子的影响

取2.1.2项下的混合对照品溶液，分别考察在不同仪器、不同色谱柱、不同流速和不同柱温情况下的相对校正因子，并综合计算各影响因素的RSD,结果经测定可知，各成分的相对校正因子RSD分别为1.1%、0.9%、1.6%、2.4%。结果见表3。

2.3待测色谱峰定位

根据相对保留时间计算公式[6]，考察不同仪器和色谱柱条件下各成分的相对保留时间，结果妇乐颗粒中5种大黄蒽醌类指标成分的相对保留时间有小范围波动，其平均值分别为0.51、0.63、1.42、1.98，RSD分别为2.1%、3.5%、2.3%、3.1%，测定结果均较稳定。

2.4QAMS法与外标法测定结果的比较

取11批妇乐颗粒样品各适量，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，分别采用QAMS和外标法计算样品中各指标成分的含量[7]，采用相对误差的方法评价两种方法的差异性，结果见表4。由表可知，上述2种方法测得的各成分含量结果没有显著性差异，RD＜5.0%，提示建立的方法具有良好的可信度。

3.讨论

本研究考察了不同仪器、不同色谱柱等因素对相对校正因子f值的影响，结果表明各因素下f值无显著性差异，表明QAMS法有较好的适用性；同时在考察过程中，发现不同品牌色谱柱对蒽醌类成分的相对保留时间有一定的影响，建议在建立标准时，可以固定一种品牌的色谱柱（如phenomenex）以提高试验结果的稳定性。

在日常试验过程中，外标法具有操作简便，计算方便等特点，但对于对照品的要求比较严格，一般的对照品都只能从中检院采购，而在采购过程中，往往会出现没货或者断货的情况，从而导致实验的无法进行，而采用QAMS法可以有效的解决此问题，通过固定较易采购到的大黄素为内参物，从而能够快速准确的计算出其他成分的含量，节约检验成本。本研究的相对较正因子采用的计算公式参考了王智民等发表的“一测多评法建立的技术指南”，经过后期对我公司生产的妇乐颗粒中蒽醌类成分的再验证，两种检测方法测得的结果无显著性差异，可知QAMS法对于妇乐颗粒中大黄蒽醌类成分的含量测定适用性良好。

【参考文献】

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京:中国医药科技出版社,2015:896-897.

[2]陆兔林,石上梅,蔡宝昌,等.基于一测多评的中药多成分定量研究进展[J].中草药,2012,12:2525-2529.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京:中国医药科技出版社,2015：23-24.

[4]孔卫东,李婷婷,濮永杰,等.一测多评法测定一清颗粒中5种蒽醌类成分[J].中国药房,2014,24:2292-2295.

[5]王智民,钱忠直,张启伟,等.一测多评法建立的技术指南[J].中国中药杂志,2011,06:657-658.

[6]王钰莹,冯伟红,杨菲,等.一测多评法测定三黄片中大黄蒽醌类成分[J].中国中药杂志,2012,02:212-217.

[7]张亚非,王雪,毕宇安,等.一测多评法测定热毒宁注射液中9种成分[J].中草药,2013.22:3162-3169.