复方香菊冲剂微生物限度检查法的验证

复方香菊冲剂微生物限度检查法的验证

黄阳曹益鸣

（昆山市中医医院江苏昆山215300）

【摘要】验证所采用的方法适用于复方香菊冲剂的微生物限度检查，即确认复方香菊冲剂在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性被充分消除到可以忽略不计。以保证检验结结果的准确、可靠及检验方法的专属性。

【中图分类号】R286.0【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）01-0308-03

方法学验证：

1.供试品

复方香菊冲剂（规格：15g/袋，批号141212,150112,150302）生产供应单位：昆山市中医医院制剂室

2.培养基及试药

MUG培养基（批号20140901）、靛基质试液（批号20140106）由北京三药科技开发有限公司生产，中国药品生物制品检定所监制；营养肉汤培养基（批号20140708）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号：20140511）、胆盐乳糖培养基（批号：20140708）、营养琼脂培养基（批号：20140519）；PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：20131220）；由上海博微生物科技有限公司生产。

3.仪器设备

双人净化工作台（型号：SW-CJ-IC、编号：424047）由苏净集团安泰公司生产；水浴锅（型号：GKCR214、编号：990422），由通州市泸通实验仪器厂生产；电热蒸气压力消毒器(型号：YX.400Z、编号：R305044)由上海三申医疗器械有限公司生产；TC-15套式恒温器(型号：TC-15)由浙江新华医疗器械厂生产。

4.菌种

枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501(4代)、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003(5代)、大肠埃希菌CMCC(B)44102(5代)、白色念珠菌CMCC(F)98001(4代)、黑曲霉CMCC(F)98003(4代).由江苏省药品检验所提供。

5.实验依据

《中国药典》2010版一部（附录ⅩⅢC微生物限度检查法）。

6.实验操作

6.1菌液制备方法

（1）取经33℃培养18～24h,金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜肉汤培养物1mL+9Ml0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10-5-10-7，制成每1mL含菌数为50～100cfu的菌悬液。

（2）取经25℃培养18～24小时的白色念珠菌的新鲜培养物1mL+9mL0.9﹪无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-6，制成每1mL含菌数为50～100cfu的菌悬液。

（3）接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养5～7天，加入3～5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-6，制成每1mL含孢子数为50～100cfu的孢子悬液。

6.2供试品溶液的制备

称取10g复方香菊冲剂加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲至100mL,混匀，作为1:10供试液。

6.3菌落计数方法的验证（平皿法）：

（1）试验组

a取10个平皿，每2个一组分成5组，分别按大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的顺序进行标记。

b取1:10的供试液1mL,分别注入10个平皿中，再依次加入上述5种菌的菌悬液1mL(50～100)cfu/mL),每种菌平行制备2个平皿，倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，分别至30～35℃培养3d和23～28℃培养5d。

（2）菌液组

分别取上述制备好的菌液1mL注入平皿内，每种菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。

(3)供试品对照组

取1:10的供试液1mL分别注入4个平皿，立即倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，分别置30～35℃培养3d和23～28℃培养5d。测定供试品本底菌数。

(4)稀释剂对照组

本品未用特殊方法处理和制备（略）。

(5)结果：见表1

(6)评价：由表1可见：复方香菊冲剂用平皿菌落计数法3次独立的平行试验中5种菌株的回收率均高于70%，说明该方法用于细菌、霉菌及酵母菌计数结果是准确的。

6.4控制菌检查方法的验证

6.4.1菌液制备方法

取经33℃培养18～24h，大肠埃希菌的新鲜肉汤培养物1mL+9mL0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10-5～10-7，制成每mL含菌数为10～100cf的菌悬液。

6.4.2大肠埃希菌检查方法的验证

（1）制备供试液与增菌培养

称取10g复方香菌冲剂加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL配成1:10供试液，然后取供试液10mL接至100mL胆盐乳糖培养基中，加验证菌株大肠埃希菌1mL（含菌数为10～100cfu，作为供试品验证组），置30～50℃培养18～24h，必要时可延至48h。

（2）MuG与靛基质测定

取上述2瓶培养物0.2mL，分别接种至2管5mLMuG培养基的试管内，30～50℃培养，于5h、24h在366nm紫外灯下观察，同时用未接种的MuG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MuG阳性，无荧光，为MuG阴性。观察后，分别沿3管培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。

6.4.3验证结果

（1）胆盐乳糖培养基增菌结果

供试品验证组呈阳性(+),有菌生长，培养时间：24h，温度：30～50℃。

（2）MuG测定结果

供试品验证组呈阳性（+），呈现荧光；本底对照组呈阴性（-）不呈现荧光。培养时间：24h，温度：30～35℃。

（3）靛基质测定结果

供试品验证组呈阳性(+);本底对照组呈阴性(-)。培养时间：24h，温度：30～35℃。

6.5结果分析

3批供试品每次验证在供试品试验组验证结果之间均无差异，所有结果一致，该法可检出供试品中的控制菌。

7.结论

复方香菊冲剂，规格;15g/袋。按《中国药典》2010年版一部附录微生物限度检查方法验证试验：取样10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，混匀制成1:10供试液细菌数测定；用常规法：霉菌及酵母菌测定；用常规法；大肠埃希菌检查；取1:10供试液10mL加入100mL胆盐乳糖增菌培养基进行增菌培养，依法进行检查。

各菌株回收率=【（试验组-供试品对照组）&pide;菌液组】×100%

结论：本品经按《中国药典》2010年版（附录ⅩⅢC微生物限度检查法）中细菌数、霉菌和酵母菌数计数验证方法验证，结果表明可用常规法检查本品的细菌数、霉菌和酵母菌数。

结论：

本品经按《中国药典》2010年版一部（附录ⅩⅢC微生物限度检查法）中控制菌检查验证方法验证，结果表明可用常规法检验大肠埃希菌。