分子筛层析在生物制药领域的应用

分子筛层析在生物制药领域的应用

罗诚

浙江省宁波荣安生物药业有限公司315800

摘要：当前，分子筛层析法是生物化学、细胞生物学、分子生物学及其他多门学科中重要的分析纯化工具之一。在生物制药领域，分子筛层析具有广泛的应用，主要集中在分离纯化、分子量测定、去热原、脱盐及浓缩等方面。

关键词：分子筛层析；生物制药；应用

分子筛层析，又称凝胶层析，是有效的分离纯化工具之一，特别是在生物制药领域具有十分广泛的应用。为了满足生物制药对于无杂质蛋白、病毒、核酸、酶及其抑制物需求的逐步增长，分子筛层析技术在生物制药领域的应用也在逐步深入。本文重点就分子筛层析在生物制药领域的应用进行介绍。

1分子筛层析的原理

分子筛层析的原理，即分子筛效应。层析所使用凝胶是由胶体溶液凝结而成，内部存在很多微小、多孔的网状结构，制成凝胶层析柱之后，通过加样、洗脱，可将待测溶液中的物质依据分子大小之间存在的差异性加以分离。其中，大分子物质无法进入凝胶内部，因而其沿着颗粒之间的缝隙先从层析柱中流出，小分子物质能够进入具有多孔网状结构的凝胶内部，因而流速慢，这样，可实现二者的有效分离。分子筛层析所采用的凝胶为惰性载体，因而不带电荷，几乎不具有吸附作用，而且操作温和，适用于较广的温度范围，无需加入有机溶剂，因而能够有效地保障溶液中各成分的理化性质。

2分子筛层析在生物制药领域的应用

2.1在脱盐与浓缩中的应用

若生物高分子物质中存在无机盐类或其他小分子物质时，可利用分子筛层析法加以脱除，实现脱盐、浓缩等目的。脱盐及浓缩属于类分离，在应用中应科学选择凝胶。用于脱盐时，应选择粒度较大、交联度较高的凝胶，以提高凝胶颗粒的强度，同时，便于进行柱层操作，提高流速。洗脱时采用易挥发盐溶液，洗脱时可能存在某些蛋白质溶解度降低的情况，导致其被凝胶吸附或析出等问题。为了确保脱盐效果，必须确保样品体积不超过内水体积的1/3。就部分脱盐而言，宜采用包埋法、直接投入法等方法。例如，对于所制备的蛋白制剂，其中可能存在氯化钠、硫酸钠等盐类杂志，可采用该方法加以脱除；再如，在制备荧光抗体时，也可采用该方法将抗体溶液中未结合色素加以脱除。

2.2在分离纯化中的应用

在生物制药领域，分子筛应用最为成功的实例当属其在猪、牛胰岛素分离纯化中的应用。采用SephadexG-50对胰岛素进行纯化，有效去除了其中存在的前胰岛素及其他抗原物质。此外，SephadexG-25能够将氨基酸混合物有效分离开，该应用除了发挥分子筛效应以外，还利用了凝胶同某些物质之间所存在的弱吸附力实现的。采用SephadexG-25进行氨基酸混合物分离过程中，氨基酸流出顺序并非依据分子量大小依次流出，而是依据吸附力大小顺序流出的，酸性氨基酸先流出，碱性氨基酸后流出。

2.3去热原中的应用

热原物质，指的是可以导致人体体温异常升高的致热性物质，主要包括细菌性、内源性、化学等热原，主要指的是细菌性热原，包括细菌代谢产物、尸体、内毒素等。其中，革兰氏阴性菌产物致热性更强，革兰氏阳性菌较弱，病毒、霉菌、酵母菌等也能产生热原物质。其属于大分子物质，因而可以采用凝胶层析法加以去除。例如，对于注射液中的热原，采用凝胶层析能够简单、有效地除去。

2.4在分子量测定中的应用

分子筛层析所具有的分子筛效应，能够对高分子物质，尤其是球形蛋白质分子量加以有效测定，通过标准曲线法加以测定。采用一系列分子量已知的标品置入同一分子筛层析柱内，在相同条件下进行层析，对每分钟各成分洗脱体积进行记录，采用洗脱体积对分子量对数进行作图，在分子量一定的范围内，可得一条直线，此即标准曲线，对于待测物质分子量而言，可将该物质样品加入凝胶柱内进行洗脱，依据所得洗脱体积对其分子量进行计算。该方法操作简单、所需样品量少，较为实用。应注意的是，该方法所测分子量为近似值，误差范围在10%以内。

3分子筛层析应用实例分析

牡蛎胰蛋白酶抑制剂是有效的海洋抗肿瘤药物成分来源之一，具有分子量小、分布范围广、抗肿瘤活性强等诸多优点，因此，如何从牡蛎中提取纯度高、活性强、安全高效的胰蛋白酶抑制剂已经成为抗肿瘤药物制备领域的研究热点。下文重点就分子筛层析在牡蛎胰蛋白酶抑制剂分离纯化中的应用进行分析。

3.1胰蛋白酶抑制剂粗品制备

采用（NH4）2SO4沉淀法，对牡蛎胰蛋白酶抑制剂粗品进行了制备，去除了大量的杂质，浓缩了蛋白酶抑制剂，提高了原料的利用效率，为后文采用分子筛层析分离工作创造了条件。

3.2胰蛋白酶抑制剂的分离与纯化

将制备的粗品采用磷酸盐缓冲液加以溶解，利用25×500mm的SephadexG-75凝胶柱对粗品进行分离和纯化，采用磷酸盐缓冲液平衡和洗脱柱子，1.2mL/min流速，280nm检测波长下对吸收峰进行收集，并对胰蛋白酶抑制剂活性加以测定。将SephadexG-75凝胶层析所得活性峰，采用10×80mm的胰蛋白酶亲和柱进行进一步分离，采用磷酸盐缓冲液作为平衡液，按3.5mL/min的流速，280nm波长下检测，采用平衡液将未结合于柱子上的穿透峰进行洗脱后，利用0.1mol/L的HCl溶液进行洗脱，对吸收峰进行收集，并对胰蛋白酶抑制的活性进行测定。将分离所得抑制剂峰，采用16×300mm的SephadexG-15凝胶柱加以脱盐处理，采用蒸馏水以2.5mL/min的流速进行平衡和洗脱，在280nm波长下，对吸收峰进行收集，对所得抑制剂活性加以测定，并将活性峰采用冷冻干燥法，获取粉状牡蛎胰蛋白酶抑制剂。

通过测定，粗品牡蛎胰蛋白酶抑制剂比活力为6.58U/mg，采用分子筛层析、亲和层析等分离纯化之后，比活力达到了299.54U/mg，纯化倍数高达45.52倍，由此可见，分子筛层析在生物活性物质分离纯化中的重要应用。

4.总结

近些年来，分子筛层析技术取得了重大的进展，且无论在工艺方面，还是经济方面均有显著改善。该技术采用的凝胶结构为其带来了较高的动态产率，也为药物分离纯化提供了理性的设计方法。未来生物制药领域，分子筛层析方法的应用研究将着眼于高通量及扩大生产规模等方面，借助于理性与组合方式加以设计，对于分子筛层析的未来应用将带来极大的影响，届时分子筛层析在生物制药中的应用前景将更为广阔。

参考文献：

[1]赵永芳.生物化学技术原理及应用[M].北京：科学出版社，2009，7-82.

[2]韩亮，刘淑玲，赵丽欣，张秀霞，杨桂云，张志，曾国华.抗基因工程干扰素单克隆抗体的纯化[J].中国生物制品学杂志，2009（2）：217-220.