二苯乙烯苷抑制牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的促炎细胞因子的分泌

二苯乙烯苷抑制牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的促炎细胞因子的分泌

范晓升1，2曹放云2李匡正2李美香1（通讯作者）

（1.南华大学医学院组织胚胎学教研室湖南衡阳421001；

2.南华大学附属第二医院口腔科湖南衡阳421001）

摘要：目的探讨二苯乙烯苷（2，3，5，4'-Tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，TSG）对牙龈卟啉单胞菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）诱导牙龈上皮细胞分泌促炎细胞因子的影响。方法实时荧光定量PCR、Westernblot测定不同时间点、不同浓度TSG刺激后HO-1mRNA以及蛋白的表达；CoPP、ZnPP干预处理后分别检测IL-1β、TNF-α、IL-6的分泌水平。结果RT-PCR、Westernblot结果显示，HO-1mRNA和蛋白水平均随TSG浓度增加而升高，并于TSG处理后12h达到最高值；用HO-1抑制剂ZnPP处理后牙龈上皮细胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-6水平明显高于TSG对照组（P<0.05），而添加了HO-1激动剂CoPP后牙龈上皮细胞IL-1β、TNF-α、IL-6的分泌水平与TSG组无显著差异（P>0.05）。结论二苯乙烯苷能够通过上调HO-1，抑制牙龈卟啉单胞菌LPS诱导的牙龈上皮细胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-6。

关键词：牙龈卟啉单胞菌；脂多糖；血红素氧合酶-1

TSGinhibitsthesecretionofproinflammatorycytokinesinducedbyPorphyromonasgingivalisLPS

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectof2，3，5，4'-Tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside（TSG）onthesecretionofproinflammatorycytokineinducedbyPorphyromonasgingivalisLPSinGingivalepithelialcell.MethodsWedetectedthemRNAandproteinexpressionofHO-1intimeandTSGconcentrationgradientsbyRT-PCRandWesternblot.ThenwemeasuredtheexpressionlevelsofIL-1β，TNF-αandIL-6afterCoPPandZnPPtreatment.ResultsRT-PCRandWesternblotresultsshowedthatthemRNAandproteinexpressionofHO-1wereincreasedinaTSGconcentrationdependentmanner，andpeakedat12haftertreatment.InHO-1inhibitorgroup，theexpressionlevelsofIL-1β，TNF-αandIL-6weresignificantlyhigherthanTSGcontrolgroup（P<0.05）.WhileinHO-1agonistgroup，theexpressionlevelsofIL-1β，TNF-αandIL-6havenosignificantdifferencetoTSGcontrolgroup（P>0.05）.ConclusionTSGinhibitsthesecretionofIL-1β，TNF-α，IL-6inducedbyPorphyromonasgingivalisLPSthroughup-regulatestheexpressionofHO-1inGingivalepithelialcells

【Keywords】Porphyromonasgingivalis；Lipopolysaccharide；Hemeoxygenase-1；

牙龈炎是一种常见的口腔慢性感染疾病，主要表现为牙龈充血、红肿、胀痛，龈乳头肥大[1]。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis，Pg）作为口腔牙菌斑中主要的病原体之一，能够通过释放大量有毒物质破坏牙周组织。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是由脂质A、核心寡聚糖以及O-特异多糖组成的细菌内毒素。它是牙龈卟啉单胞菌主要毒力因子之一，能够促进炎症反应和骨质吸收[2]。

二苯乙烯苷（2，3，5，4'-Tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，TSG）又名芪多酚，是一种植物性的天然抗毒素，具有降血脂、抗肿瘤、抗氧化应激、抗炎症反应等作用[3]。尽管已经有足够的证据表明TSG具有较强的抗氧化应激以及抗炎作用，但其能否影响牙龈卟啉单胞菌LPS所致的炎症反应目前尚不明确。血红素氧合酶（Hemeoxygenase，HO）是血红素降解过程中的一种氧化酶，它能够将血红素分解成胆绿素和CO，进而在体内发挥相应的细胞保护功能[4]。本课题组前期研究发现，TSG可以通过Nrf2诱导HUVECs使HO-1表达上调，进而抑制过氧化氢诱导产生的内皮细胞凋亡。而TSG能否通过调节HO-1的表达来影响牙龈卟啉单胞菌LPS的致病作用仍然未知。

本研究初步探索了TSG抑制牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导牙龈上皮细胞分泌促炎细胞因子的反应机制，为牙龈口腔疾病的预防和治疗提供了新的靶点。

1.材料方法

1.1RT-PCR检测HO-1mRNA的表达

用不同浓度的TSG：0、1.0μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L刺激牙龈上皮细胞0、6、12、18、24h后，用Trizol（Invitrogen）试剂严格按照说明书收集各浓度下细胞总RNA样本。并按要求检测HO-1mRNA表达情况。

1.2Westernblot检测HO-1蛋白的表达

不同浓度的TSG刺激后提取细胞总蛋白。SDS-PAGE跑胶后转膜至PVDF上，转膜完成后37℃封闭1h。封闭完成后加入一抗4℃孵育过夜。第二天将膜取出，洗涤三次后二抗37℃孵育2h。TBST洗涤3次后印干后加入发光液，在化学发光仪中显影。

2.结果

2.1TSG对牙龈上皮细胞HO-1mRNA表达的影响

实时荧光定量PCR测定TSG刺激后HO-1mRNA的表达水平。阴性对照组（无LPS）HO-1mRNA表达水平较低。LPS刺激后HO-1的表达水平无显著增加。不同浓度TSG处理后，HO-1mRNA表达水平出现显著增加（P<0.05）。在不同时间点分别检测HO-1mRNA的表达水平，发现HO-1的表达水平在6h后开始上升，并于12h达到峰值后开始出现下降。

图2.TSG诱导牙龈上皮细胞HO-1蛋白表达上调.A为浓度依赖图.B为时间依赖图

Figure2.TSGcanup-regulationofHO-1proteinexpressioningingivalepithelialcells.

2.3HO-1抑制剂、激动剂对细胞因子分泌的影响

HO-1激动剂CoPP处理牙龈上皮细胞后用LPS刺激，结果显示：与TSG对照组相比，三种细胞因子产生水平无显著差异（P＞0.05）。HO-1抑制剂ZnPP处理后，TSG预处理并加入LPS刺激，结果显示相较于TSG对照组，加入了HO-1抑制剂的实验组三种细胞因子均有显著增加（P<0.05）。

图3.HO-1抑制剂、激动剂对细胞因子分泌的影响.A、B、C

分别为IL-1β、TNF-α、IL-6的表达水平

Figure3.EffectofHO-1inhibitorsandagonistson

cytokinesecretion.*P<0.05.

3.讨论

本研究通过提取培养健康成年人牙龈组织的牙龈上皮细胞，建立牙龈卟啉单胞菌LPS的刺激模型，发现TSG能够上调HO-1的表达水平，抑制LPS诱导的促炎细胞因子分泌。这对研究牙龈卟啉单胞菌的预防治疗策略寻求了新的靶点。研究显示，二苯乙烯苷具有多种生理活性以及药用价值，具有抗衰老、降低血脂及抗动脉粥样硬化、保肝护肝、改善记忆、抗肿瘤等功能[5]。我们之前的研究也发现，TSG能够作用于内皮细胞，显著调高细胞增殖率，降低细胞凋亡率，并显著减少Caspase-3和PARP的表达[6]。本研究中TSG作用与牙龈上皮细胞时，也能够显著降低牙龈卟啉单胞菌LPS诱导的炎性细胞因子分泌。HO-1是一种氧化酶，能够使血红素生成CO和胆绿素，同时它也是相关产物发挥抗氧化作用的关键分子。我们发现不同浓度TSG均可诱导牙龈上皮细胞HO-1mRNA表达上调以及HO-1蛋白表达增加，并且随着TSG浓度的增加，HO-1的含量呈递增趋势。

而为了进一步探究HO-1在TSG抑制炎性细胞因子分泌过程中的作用，我们在用TSG处理牙龈上皮细胞的同时加入了HO-1抑制剂ZnPP。结果显示，加入抑制剂ZnPP后TSG抑制炎性细胞因子分泌的能力显著降低，IL-1β、TNF-α、IL-6均恢复至较高水平。同时我们采用HO-1激动剂CoPP直接孵育牙龈上皮细胞后用LPS刺激，发现炎性细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6分泌水平与TSG处理组相似。以上结果进一步证实，TSG对炎性细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的抑制作用主要是通过调节HO-1表达上调而实现的。

牙龈卟啉单胞菌脂多糖作为其主要致病因子所发挥的致病作用至关重要[7]。本研究发现TSG能够通过调节HO-1的表达，进而抑制牙龈卟啉单胞菌LPS诱导产生的促炎细胞因子，这对于控制牙龈卟啉单胞菌引起的牙龈炎具有重要意义。而HO-1作为机体抵抗外源性刺激的关键分子，其具体的作用机制仍有待我们的进一步研究。此外，考虑到TSG取自天然植物，存在易提取且安全无毒等特点，同时还能以HO-1作为作用靶点，这对于牙龈炎的防治可能具有重要的临床意义。

参考文献

[1]StoyellKA，MappusJL，GandhiMA.Clinicalefficacyofturmericuseingingivitis：Acomprehensivereview.ComplementTherClinPract.2016.25：13-17

[2]HaasAN，WagnerTP，MunizFW，FioriniT，CavagniJ，CelesteRK.Essentialoils-containingmouthwashesforgingivitisandplaque：Meta-analysesandmeta-regression.JDent.2016.55：7-15.

[3]LeeSY，AhnSM，WangZ，etal.Neuroprotectiveeffectsof2，3，5，4'-tetrahydoxystilbene-2-O-β-D-glucosidefromPolygonummultiflorumagainstglutamate-inducedoxidativetoxicityinHT22cells.JEthnopharmacol，2017，195：64-70.

[4]GompertsE，BelcherJD，OtterbeinLE，etal.Theroleofcarbonmonoxideandhemeoxygenaseinthepreventionofsicklecelldiseasevaso-occlusivecrises.AmJHematol，2017，92（6）：569-582.

[5]ShengC，PengW，ChenZ，etal.Impactof2，3，5，4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucosideoncognitivedeficitsinanimalmodelsofAlzheimer'sdisease：asystematicreview.BMCComplementAlternMed，2016，16（1）：320-326.

[6]龙石银，张彩平，乔新惠等.二苯乙烯苷对氧化诱导内皮细胞凋亡及Caspase-3和PARP表达的影响.生物化学与生物物理进展.2011.38（11）：1052-1059.

[7]LiM，ZhangC，JinL，MatsuoK，YangY.Porphyromonasgingivalislipopolysaccharideregulatesephrin/Ephsignallinginhumanperiodontalligamentfibroblasts.JPeriodontalRes.2017.52（5）：913-921.