海南砂仁对肝源性溃疡大鼠胃粘膜EGF及EGFR的影响

海南砂仁对肝源性溃疡大鼠胃粘膜EGF及EGFR的影响

高湲孙涛谢毅强杨世忠

海南医学院海口571199

【摘要】目的：观察海南砂仁对肝源性大鼠胃粘膜表皮生长因子(EGF)及表皮生长因子受体(EGFR)的影响。方法：成年健康雄性SD大鼠50只，随机分为5组，正常组、模型组、普萘洛尔组、海南砂仁低剂量组、海南砂仁高剂量组。除正常组外，其余四组在成功复制免疫损伤性肝纤维化大鼠模型的基础上，采用无水乙醇和阿司匹林灌胃法建立胃溃疡大鼠模型。①溃疡指数测定；②免疫组织化学法检测大鼠胃粘膜EGF和EGFR的表达；③Real-timePCR法，对胃粘膜及EGFmRNA行定量检测和分析。结果：①除正常组外，其余各组大鼠溃疡指数均较高，普萘洛尔组和海南砂仁低、高剂量组溃疡指数均低于模型组（P<0.05）；②免疫组化：大鼠胃粘膜EGF和EGFR的表达模型组略高于正常组，普萘洛尔组、海南砂仁低、高剂量组均有明显提高，尤以海南砂仁高剂量组提高明显；③EGFmRNA在模型组和正常组比较无差异（P>0.05），与砂仁低剂量组无明显差异（P>0.05），高剂量组和西药组均有明显升高，两组的效果最接近(P>0.05)。结论：海南砂仁对大鼠胃粘膜损伤具有保护作用，其机制可能与提高EGF和EGFR的表达有关。

【关键词】海南砂仁肝源性溃疡胃粘膜EGFEGFR

【中图分类号】S857.11+1【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2015）-09-038-03

海南砂仁具有健脾化湿，行气止痛等作用，常用于腹痛胀满、食欲不振、恶心呕吐，反酸嗳气等症。现代药理研究证实砂仁可增强胃的功能，促进消化液的分泌，增进肠道运动，排出消化管内的积气，可起到帮助消化，消除肠胀气等症状，对溃疡有明显抑制作用。本实验通过海南砂仁的干预，观察其对实验性大鼠胃粘膜表皮生长因子（EGF）、表皮生长因子受体(EGFR)的表达以及对EGFmRNA基因表达的影响，探讨海南砂仁改善肝源性溃疡，促进溃疡愈合的作用机制。

1材料

1.1动物SPF级雄性SD大鼠50只，体质量(180±20)g，长沙市天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2009-0012。

1.2药品

砂仁购自海南省海口市国瑞堂医药公司，经海南医学院药学院鉴定为南药砂仁的干燥成熟果实。按常规法自治煎剂，即冷水浸泡30min，煮沸10min，过滤药液，加水再煎煮10min，合并两次滤液，并将其配成生药浓度为20%、50%的水煎液备用，冷却后装瓶置于4℃冰箱中保存备用。普萘洛尔10mg/片，国药准字427H43400，广东金葫芦制药有限公司生产，研粉备用。无水乙醇、阿司匹林购自海南医学院附属医院。

1.3实验主要试剂及仪器

1.3.1主要试剂

免疫组化试剂盒：表皮生长因子（EGF）、表皮生长因子受体(EGFR)，配套使用稀释液（1：100）（批号：SA1022）；DAB显色剂以上试剂均购自武汉博士德生物工程公司。主要试剂：PS2、ITF抗体，免疫组织化学(S-P)法试剂盒及EGFR一抗。TRIzol试剂，Taq酶，Rnasin，MMLVRT反转录酶，SYBRgreen，DNAMarker，oligodT序列：5'-TTTTGTA-CAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'；B-actin(263bp)：

上游5'-GAGACCTTCAA-CACCCCAGCC-3'，

下游5'-AATGTCACG-CACGATTTCCC-3'；EGF（404bp）上游：5′-CACCATCCATGACATGAACC-3′

下游：5′-TCATGTTGGACAACTCCTCC-3′

1.3.2主要仪器

7000型实时荧光定量PCR系统；紫外分光光度计；-20℃低温冰箱（日本Sanyo公司）；低温高速离心机；恒压恒流电泳仪；切片机(LEZCARM2135)；BMJ-Ⅲ型包埋机；BH-2型光学显微镜；显微摄像仪；GD-8病理摄像多媒体分析仪；Tanon1600凝胶图像分析仪。

2方法

2.1动物模型制备与给药雄性SD大鼠60只，随机分为5组，每组12只。正常组（N组）、模型组（M组）、普萘洛尔组（P组）、海南砂仁低（HSD组）、高剂量组（HSG组）。除N组外（生理盐水ip2mL/只，2次/周），其他四组按照文献［1-2］等方法略加改进，复制免疫损伤性肝纤维化大鼠模型，2次/w，0.5ml/只，造模4周。第五周开始，除N组用0.9%生理盐水灌胃（2ml/只，2次/w）外，其余各组均采用无水乙醇和阿司匹林灌胃法建立胃溃疡大鼠模型［3］。

造模成功后，从第6周开始，N组和M组均给与等量的生理盐水，1ml/100g体重灌胃，P组给予普萘洛尔5mg/kg•d，HSD组、HSG组予2ml/kg•d灌胃，连续两周。2.2取材给药结束后，对各组大鼠禁食24h后，予2%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉后处死，剖检取胃，观察并采集标本。用于各项指标的测定。

取出全胃，沿胃大弯剖开，分别切取胃窦部、胃体部及胃底部一部分组织，剪取包括溃疡部位的胃黏膜组织，大小约0.5cm×1.0cm，用10%中性甲醛固定制备石蜡切片光镜标本和免疫组化标本；一部分组织液氮速冻，-70℃度冰箱保存以备提取总RNA。剩余组织刮取粘膜，备用。

2.3指标检测

2.3.1一般情况观察大鼠毛色、精神、活动量、饮食、大便、体质量情况，每周称量一次体重。

2.3.2溃疡指数(GastriculcerGUI)的检测以游标卡尺测量溃疡面的最大长径和垂直于最大长径的最大宽径，以二者的乘积作为溃疡指数。

2.3.3免疫组织化学（SP法）观察胃粘膜EGF、EGFR蛋白表达处死大鼠，摘取全胃并清洗，肉眼观察胃粘膜情况，并刮取胃粘膜组织，大小约0.5㎝×1.0㎝，置于10%中性甲醛固定液中固定24h。采用S-P法染色，切片常规脱蜡水化，柠檬酸缓冲液热修复。兔抗鼠单克隆抗体EGF、EGFR（按1：100稀释）4℃孵育过夜。其他操作步骤，按试剂盒说明书进行。对照实验用PBS替代一抗进行上述免疫组化反应，光学显微镜观察阳性表达。结果以细胞膜和细胞质内出现棕黄色颗粒为判定标准。按阳性区域表达由强至弱分为：强阳性(+++)、阳性(++)、弱阳性(+)、阴性(－)［4］。GD-8病理摄像多媒体分析仪在电脑上对图片进行分析，由电脑自动得出每张片的灰度值和光密度值，再求出平均值。观察比较各组表达，并进行量效比较。

2.3.4Real-timePCR法，对胃粘膜及EGFmRNA行定量检测和分析

①提取总RNA及反转录反应Trizol一步法提取总RNA。

紫外-分光光度计测定所提取RNA浓度。反转录反应体系：总RNA2Lg，OligodT(0.5g/mL)2μL，dNTP(10mmol/mL)3μL，DTT(0.1mol/mL)2μL，Rna-seinhibitor(40U/μL)1μL，MMLV-RT(200U/μL)1μL，5×MMLV-RTBuffer6μL，加入DEPC处理过的无菌水至30μL；反应条件：45℃反应1h，95℃5min终止反应。

②Real-timePCR反应

20μL的PCR反应体系含：10μL的2×SYBRGreenPCRMasterMix，5.4μL的RNaseFreeWater，上、下游引物(0.05mg/mL)各1.8μL和1μL的cDNA。反应条件：预变性，94℃，5min；变性，95℃，30s；退火，58℃，30s；延伸，72℃，30s；共进行40个循环的扩增，72℃后延伸5min。实验中同步进行内参基因B-actin的定量检测，以目的基因与内参基因相对浓度比作为目的基因的相对表达量。扩增反应在ABI7000荧光定量PCR仪上进行，各样品的荧光信号值由荧光定量PCR仪的支持软件ABIPrism7000SDSsoftware实时产生并自动计算定量数值。

2.4统计方法各样品目标基因的相对表达水平通过内参基因进行校准后用x±s表示，组间差异使用t检验。计数资料用PEMS3.1软件分析，比较用x2检验，所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行分析。P<0.05为有统计学意义。

3.结果：

3.1一般情况观察：造模成功后，除N组外，其他各组大鼠均出现活动减少，饮食量减少，蜷卧嗜睡，脱毛，便溏，体质量下降。随灌胃（造模）次数的增加，上述症状更加明显。

3.2大体观察模型组胃粘膜皱襞变浅或消失，有圆形溃疡形成，直径约在0.3-0.5㎝之间，中心颜色苍白，边界清楚，底部平坦，溃疡周围胃粘膜充血、水肿明显。海南砂仁低剂量组胃粘膜皱襞存在，可见直径约0.1-0.3㎝溃疡面，溃疡周围胃粘膜轻微充血；海南砂仁高剂量组胃粘膜皱襞基本正常，无溃疡面；普萘洛尔组皱襞存在，未见溃疡面。

3.3溃疡指数

表1给药后各组大鼠溃疡指数比较（x±s）

表2显示：正常组呈弱阳性表达；模型组EGF及EGFR的表达均略高于正常组；干预后EGF及EGFR的表达均明显高于模型组（P<0.05）；尤以海南砂仁高剂量组显著（P<0.01）。其表达主要在胃底腺细胞的细胞膜和细胞质。低、高剂量组间有显著差异(P<0.05)；西药组与高剂量组无差异（P>0.05）

3.5各组大鼠胃粘膜EGFmRNA蛋白表达见表3、图1

表3各组大鼠胃粘膜EGFmRNA蛋白表达（x±s）

图1显示：EGFmRNA在模型组和正常组比较无差异（P>0.05），与砂仁低剂量组无明显差异（P>0.05），高剂量组和西药组均有明显升高，两组的效果最接近(P>0.05)。

4讨论

肝纤维化或肝硬化合并消化性溃疡，称为肝源性溃疡（HU）。其临床特点与一般消化性溃疡相似，但也有其自身特点。溃疡病变部位以胃窦部溃疡多见。

EGF是一种含有53个氨基酸的单链多肽，具有广泛的生物学作用，与消化系统的关系密切，它可抑制胃酸分泌，促进胃肠粘膜上皮的分化、增生，促进成纤维细胞的生长以及胶原产生的作用，能显著增加胃粘膜血流，参与粘膜上皮的更新以及损伤后的修复，是一种重要的促进溃疡愈合的调节因子［5-6］。但EGF发挥作用依赖与其受体EGFR的特异性结合。

EGFR是一种具有酪氨酸活性的重要跨膜受体，参与调节胃粘膜上皮更新和修复过程。研究发现大鼠胃粘膜组织EGF与EGFR的表达有同步性，且与胃溃疡愈合质量一致［7］。Tarnawski的研究发现［8］当胃粘膜发生溃疡后，损伤组织边缘粘膜EGF及EGFR表达增加，在两者的作用下，粘膜上皮成分发生增殖、移行，逐渐覆盖溃疡底部，促进溃疡愈合。中医对此病的认识，认为是因外感六淫、饮食劳伤、七情内伤等病因，导致脏腑的功能异常，肝失疏泄、脾失运化，气机失调，气血运行不畅，气滞血瘀；津液输布异常，痰湿停聚。而胃为多气多血之腑，当气机不畅，阴血亏损，血脉瘀阻时，胃粘膜的微循环受到影响，导致粘膜的局部缺氧缺血而产生胃粘膜损伤的病变。海南砂仁属于四大南药之一，药物有效成分为砂仁挥发油（挥发油成分主要包括乙酸乙脑酯5%-47%、樟脑4%-17%、龙脑1.5%-6%等），性味辛温，气味芳香，归脾胃经，具有健脾化湿，行气止痛，温脾止泻等作用。在中医治疗胃肠疾病中应用广泛，具有确切的疗效。常用于腹痛胀满、食欲不振、恶心呕吐，反酸嗳气等症。

从本研究结果分析：正常大鼠胃粘膜呈弱阳性，说明EGF及EGFR是维持胃黏膜完整性的结构基础，其他各组在胃粘膜受损后，EGF及EGFR表达均有提高，尤其在溃疡边缘EGF、EGFR表达明显增强，说明在胃粘膜受损的组织修复过程中，胃粘膜自身可产生EGF、EGFR参与粘膜修复。砂仁组能明显提高两者的表达，与西药组相比，砂仁高剂量组有明显提高。表明砂仁可能通过加强EGF与EGFR的特异性结合，促进胃粘膜组织的再生、重建和修复。这可能是砂仁治疗消化性溃疡的主要机制之一。

参考文献：

［1］于世瀛，贲长恩，杨美娟，等.活血化瘀方药抗大鼠肝纤维化的形态学和组织化学定量研究［J］.中西医结合肝病杂志，1996，6(2)：21

［2］中野雅行，小形岳三郎，猪血清による肝硬变样纤维化の形态学の研究.日本病理学会会志，1982，71∶319

［3］探索理想的大鼠慢性胃溃疡模型的建立方法陈志锋汕头大学医学院硕士学位论文2009.9-2012.6

［4］郑伟汪宝军叶立民灰度值光学密度值与免疫组化片阳性表达强弱的关系临床与实验病理学杂志［J］.临床与实验病理学杂志，2003，19（5）：566-567

［5］ElliottSN，WallaceJL，McKnightW，etal，Bacterialcolonizationandhealingofgastriculcers：theeffectsofepidermalgrowthfactor［J］.AMJPhysiolGastrointestLiverGastrointestLiverPhysiol，2000，278(1)：105-112.

［6］AlisonMR，ChineryR，PoulsomR，etal.Experimentalulcerationleadstosequentialexpressionofspasmolyticpolypeptide，intestinaltrefoilfactor，epidermalgrowthfactorandtransforminggrowthfactor-alphamRNAsinratstomach［J］.JPathol，1995，175(4)：405-414.

［7］文国容徐靖宇浏雪梅等.胃乐散对大鼠胃溃疡砧膜EGF、EGFR和TGF-β1的影响及意义［J〕.时珍国医国药201223(1)：3-4

［8］TarnawskiA，JoneMK.Theroleofepidermalgrowthfactor(EGF)anditsreceptorinmucosalprotection，adaptationtoinjury，andulcerhealing：involvementofEGF-Rsignaltransductionpathways［J］.JClinGastroenterol，1998，27(Suppl1)：S12-20.

第一作者：高湲，硕士，教授，从事中医消化病研究，Tel：0898-66890539，E-mail：2524106149@qq.com

通讯地址：海口市城西学院路3号海南医学院中医学院

邮编：571199

Tel：13322005812

E-mail：2524106149@qq.com

收稿日期：

基金项目：2014年海南省自然科学基金资助项目（814302）

通讯作者：孙涛，硕士，讲师，中医脾胃病研究，Tel：13700440416，E-mail：444822696@qq.com