多重聚合酶链式反应检测Y染色体的AZF缺失

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多重聚合酶链式反应检测Y染色体的AZF缺失

田平

田平(黑龙江省森工总医院150040)

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2011)39-0247-02

【关键词】多重聚合酶链式反应Y染色体AZF缺失

在男女不孕不育症中,男性血不育的因素约占40%,有文献报道:90%的男性不育症是由于生精功能障碍引起的,其中特发性生精障碍占60%,半数以上属原因不明者。而Y染色体正常与否起着至关重要的作用,因此研究Y染色体的相关基因有重要的临床价值。

在少精症和无精症的男性患者中,Y染色体向失占20.5%,据对Y染色体遗传序列的研究证实,Y染色体上向缺失是引起男子不育的主要原因之一。

Tiepolo和Zuffardi等于1979年发现在Yq11在存在着“无精子因子”(AZF)。它决定男性的精子生成。经实验证实,约13%的非梗阴性的少精或无精症患者是由于Y染色体长臂上的AZF缺失造成,而随机选择的有生育能力的男子无此缺失。这些缺失位于AZFa,AZFb,AZFc区域(如图1所示),这些区域中含有很多基因,我们设计了一个实验,通过对每个区域接近中心的位点进行一次PCR扩增来研究三个AZF区的缺失情况。在AZFa区域,我们检测SY87基因;在AZFb区域,我们检测SY143基因;在AZFc区域,我们检测精子缺乏基因(DAZ)的外显子2。所有检测可以在同一管内完成,同时选用染色体上的基因RhE作为对照。

1材料和方法

1.1研究对象

15例经查无精中少精的男情不育患者(患者的确诊符合国际标准:无精症为精液中无精子;少精症为精子总数<4000万或<2000万/ml)的外周血样本,患者均为2007年6月至2009年6月因不育来本院男科就诊的患者,年龄在26~36岁之间。正常人对照2名,男、女各一例,均有正常孕产史,年龄在26~36岁之间。

采用PUREGENE试剂盒提取0.5ml外周血细胞DNA。

1.2多重聚合酶链反应(PCR)

选用染色体上男、女共有的基因RhE作为对照。引物序列由美国遗传与不育诊疗中心提供,上海生工生物工程公司合成。在24μl反应体系中含AZFa、AZFb、AZFc、AZFE引物,dNTP,PCR缓冲液,Taq酶,双蒸水及1μ1SUSG。PCR扩增程序为:94℃预变性8分钟;然后50℃1分钟,72℃1分钟,共循环32;之后15℃10分钟。放室温至电泳。

1.3电泳

配制12%聚丙烯酰氨凝胶。每管反应物中加入2μl溴酚蓝,充分混合。每管取10μl加于胶孔中,同时加100bp分子量标准,400V电泳30分钟。在0.5mg/LEB溶液中染胶5分钟。在透射式紫外灯下观察结果(如图2)正常男性对照有SY87、SY143、DAZ、RhE四条带,正常女性对照只有RhE一条带,空白对照没有带。

2实验与结果

2.115例患者的外周血标本经外同血细胞G显带染色体分析均未见异常。

2.212%聚丙烯酰氨背后胶垂直电泳

正常男性对照有SY87、SY143、DAZ、RhE四条带,正常女性对照只有DAZ一条带,空白对照没有逞。经实验测定,在15例患者中,有2例患者DAZ带缺失,有1例患者缺失SY87、SY143、DAZ三条带。结果如图2,3所示。

3讨论

根据文献报道,Y染色体的微缺失发病率为1%~55.5%,其中非梗阻性的无精症患者平均为12%,严重少精症患者为6%。这个数学变化这么大,原因之一是各个实验室对患者的筛选标准不一致。另一个可能的原因是各个实验室所选择的目标序列(STS)及其数目不同。有的研究人员只选用一个位点,有的研究人员选用多个位点进行筛先。根据相关资料,本研究选择三个AZF区域的接近中心的位点进行实验,既可以筛选出造成生精障碍的患者,又避免了不必要的浪费。

Y染色体由于含重复序列的长区域,所以容易缺失。目前关于Yq的缺失可以引起精子生成异常有两种假设。一种假设认为,精子生成障碍完全由AZF区域所单独决定,每个患者症状的轻重由AZF区域所缺失的某一个或某几个基因而决定。在这一假设中,AZF区必须由至少两个精子生成基因构成。根据这种假设精子生成能力的下降的严重程度与Y染色体的缺失程度成正经。另一种假设认为,在环境、随机因素或AZF区域之外的其他基因的共同作用下,使AZF的缺失具有临床意义。由于我们所做的病例不多,还不能推断哪一种假设更切合实际。

AZF可能是一个单一基因,也可能是多个基因,它编码的蛋白质迄今为止还是未知的。目前认为编码RNA结合蛋白的DAZ基因是AZF的功能基因。在我们所检测的少精症患者中,有Y染色体微缺失的,都有DAZ基因的缺失。如果DAZ的缺失是造成男性少精症的原因,那么DAZ的点突变也能造成少精症。

这项检测对于因为男性患少精症而进行辅助生育的夫妇有重要意义。因为通过卵泡浆内单精子注射(ICSI)技术而使少精症的患者妻子爱孕,如果这位患者罹患了Y染色体细微缺失的患者。因此,在实施辅助生育技术之前,对有适应症的患者进行这项检查有重要意义。

参考文献

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