Ndfip1对MPP+诱导的PD细胞模型的保护作用涉及对Caspase9和Caspase3活性的影响

Ndfip1对MPP+诱导的PD细胞模型的保护作用涉及对Caspase9和Caspase3活性的影响

程宏1（通讯作者）刘晴谐1虞茜倪梦瑶杨凯丽

扬州大学医学院江苏扬州225001

摘要：目的：研究Ndfip1保护PD细胞模型过程中对Caspase9及Caspase3活性的影响；初步探讨Ndfip1对PD细胞模型保护作用的机制。方法：在以往工作基础上，采用MPP+诱导培养的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞模型作为研究对象，通过MTT、WesternBlotting等方法研究Ndfip1对MPP+诱导的PD细胞模型保护作用过程中对Caspase9及Caspase3活性的影响。结果：Ndfip1的表达可保护帕金森病细胞模型，减少细胞凋亡，同时引起Cascase-9及Caspase-3的活性降低。结论：过表达Ndfip1可能对PD细胞模型的凋亡起抑制作用，能有效的减少凋亡细胞的数目，对神经细胞有一定的保护作用，Ndfip1的这种神经保护作用的机制可能涉及降低Cascase-9及Caspase-3的活性。

关键词：Ndfip1；神经保护作用；帕金森病；MPP+；细胞凋亡

[Abstract]Objective：ToinvestigatetherolesofNdfip1onCaspasesandPDrelatedgenesduringtheneuroprotectionofNdfip1toPDmodelcellsandpreliminarilydiscussthemechanismoftheneuroprotectionofNdfip1.Methods：Basedonpreviousstudy，MPP+inducedSH-SY5YcellswereusedasPDmodelcells.MTTandWesternblottingwerecarriedouttostudythealterationofCaspasesactivityduringtheneuroprotectionroleoftheNdfip1.Results：OverexpressionofNdfip1maycausetheneuroprotectionofPDmodelcellsthroughdecreasingtheapoptosis，decreasingtheactivityofCaspase-9andCaspase-3.Conclusion：OverexpressionofNdfip1hastheneuroprotectionthroughattenuatingtheapoptosisofPDmodelcellsanddecreasingthenumberofapoptoticcells.ThemolecularmechanismmayinvolvedecreasingtheactivityofCaspase-9andCaspase-3.Thedetailsofthemechanismneedfurtherinvestigation.

[Keywords]Ndfip1；Neuroprotection；Pkarkinson’sdisease；MPP+；Apoptosis

随着老龄社会的来临，帕金森病（Parkinson'sdisease，PD）等神经退行性疾病的研究越来越引起重视，但迄今为止有关PD的发病机制仍未清晰。已有的研究结果提示，PD的发生与细胞凋亡和泛素蛋白酶体功能障碍有明显联系；同时，也有多个研究小组的结果表明Ndfip1通过调节泛素化作用及减少细胞凋亡来实现对神经细胞的保护作用[1，2]。基于此，本文以目前使用较为广泛的MPP+（1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶）来诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y形成PD细胞模型，研究Ndfip1对该PD细胞模型的影响，探讨Ndfip1对PD可能的神经保护作用与调控Caspase9及Caspase3活性的关系。

1材料与方法

1.1药品与试剂

胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、双抗（青、链霉素）等购自南京维森特生物技术有限公司；MTT、4HT（4-hyfroxytamoxifen）、MPP+为SIGMA公司产品；AnnexinV凋亡检测试剂盒购自凯基生物技术公司；Caspase9及Caspase3抗体购自CellSignaling公司。

1.2MTT法[3]

Ndfip1内源性表达（WT-SY5Y）、过表达（SY5Y-N）、显性负表达（SY5Y-D）及抑制表达（SY5Y-I）四种不同SH-SY5Y细胞模型用含10%FBS的DMEM高糖培养基于37℃、5%CO2培养箱培养。在96孔板调节细胞密度为2000个/孔，培养至单层铺满；对细胞干预20h后加入MTT溶液（5mg/ml），培养4h后吸去培养液并加入二甲基亚砜，充分溶解后使用酶标仪（Bio-Tek）在570nm测量吸光值。

1.3流式细胞术

胰酶消化细胞，PBS洗涤，加入BindingBuffer悬浮细胞，加入AnnexinV-FITC混匀后加入PI再混匀，室温避光15min后流式细胞仪检测。

1.4免疫印迹

采用细胞裂解液（碧云天）裂解细胞；采用Caspase9及Caspase3抗体检测Ndfip1与Caspase活性的关系。

1.5统计学分析

采用SPSS11.0软件对实验数据进行分析，数据均以±s表示，采用t检验分析数据。以P<0.05为具有显著性差异。

2结果

2.1不同处理方法对四种细胞模型细胞存活率的影响

随着MPP+浓度增高，细胞存活率明显降低，在浓度为0.3mmol/L左右，细胞生长受到有效抑制，因此，在以下实验中均采用0.3mmol/LMPP+。

MPP+可引起四种细胞模型相似的细胞死亡率，表明MPP+可诱导SH-SY5Y细胞形成PD细胞模型（图1）。当同时加入MPP+及4HT后SY5Y-N细胞中由于Ndfip1的大量表达而明显逆转了细胞的死亡，与只加入MPP+组及其他各组相比有显著性差异（P<0.05）。

2.3Ndfip1对Caspase9及Caspase3活性的影响

加入MPP+48h后，PD模型细胞中Caspase9及Caspase3活化片段明显增加，表明Caspase9及Caspase3参与了MPP+引起的细胞凋亡（图3）。而过表达Ndfip1可减少细胞中Caspase9及Caspase3的活化，这与其抑制细胞凋亡，具有神经保护作用的结果一致（图4）。

3讨论

Ndfip1蛋白是2000年发现的一种跨膜蛋白，它可通过催化某些靶蛋白与泛素E3连接酶之间的结合而参与调节泛素化过程，其中PY模体的存在与Ndfip1的功能密切相关[4，5]。PY模体显性负突变体可使Ndfip1的功能丧失，因此显性负的使用有助于更好的研究Ndfip1的功能和作用机制。与此同时，shRNA可有效抑制Ndfip1的表达和功能的发挥。因此本研究采用WT-SY5Y、SY5Y-N、SY5Y-D及SY5Y-I四种不同细胞以便更好地研究Ndfip1的作用。

多项研究结果表明Ndfip1对神经细胞具有保护作用，其机制可能涉及细胞凋亡及泛素化调节；而迄今为止，PD的发病机制仍不清楚，但很可能涉及细胞凋亡及泛素-蛋白酶体系统（UPS）功能障碍[2，6]，因此研究Ndfip1与PD之间的关系有重要意义。本研究发现经MPP+诱导后细胞存活率明显降低，细胞凋亡明显增多，可形成PD细胞模型[7]。过表达Ndfip1可显著降低由于MPP+诱导导致的细胞凋亡，细胞存活率也明显较高（P<0.05），表明Ndfip1具有很好的神经保护作用。同时本研究发现Ndfip1可减少由于MPP+诱导而导致的细胞中Caspase9及Caspase3的活化，说明在PD形成中可能涉及细胞凋亡，而Ndfip1的抗凋亡作用可能与Caspase9及Caspase3有关。本研究结果将有助于阐述Ndfip1的作用机制，也为PD的临床治疗开辟了一个新的视角。

参考文献：

[1]GormanAM.Neuronalcelldeathinneurodegenerativediseases：recurringthemesaroundproteinhandling[J].JCellMolMed，2008，12（6A）：2263-2280.

[2]褚玉霞，王静.帕金森病研究进展分析[J].医学综述，2006，12（18）：1112-1113.

[3]吕俊明，左安华，王永振，等.桂皮酸与Ndfip1联合作用对人肝癌细胞SMMC-7721细胞增殖与凋亡具有协同效应[J].实用临床医药杂志，2011，15（24）：27-30.

[4]左安华，程宏.Ndfip1蛋白的结构与功能[J].生命的化学，2009，29（5）：649-653.

[5]HowittJ，PutzU，LackovicJ，etal.palentmetaltransporter1（DMT1）regulationbyNdfip1preventsmetaltoxicityinhumanneurons[J].ProcNatlAcadSciUSA，2009，106（36）：15489-15494.

[6]MatsudaN，TanakaK.Doesimpairmentoftheubiquitin-proteasomesystemortheautophagy-lysosomepathwaypredisposeinpidualstoneurodegenerativedisorderssuchasParkinson'sdisease[J]?JAlzheimersDis.2010，19（1）：1-9.

[7]MartinHL，MounseyRB，MustafaS，etal.Pharmacologicalmanipulationofperoxisomeproliferator-activatedreceptorγ（PPARγ）revealsaroleforanti-oxidantprotectioninamodelofParkinson'sdisease[J].ExpNeurol，2012，235（2）：528-538.

通讯作者：程宏（1971-），男，江苏扬州人，博士，副教授，主要研究方向：肿瘤及神经退行性疾病的基础研究。

基金项目：国家自然科学基金（31071216）和江苏省大学生实践创新训练计划（201411117019Z）资助项目。