钙离子阻滞剂对铁诱导神经干细胞损伤的保护作用

钙离子阻滞剂对铁诱导神经干细胞损伤的保护作用

陈文雄1黄珍妮2杨默3吴武田4苏焕兴5陈

陈文雄1黄珍妮2杨默3吴武田4苏焕兴5陈志峰*2

（1.广州市妇女儿童医疗中心神经康复科广东广州510623；2.香港大学李嘉诚医学院儿童与青少年系）

（3.南方医科大学南方医院血液科510515；4.香港大学李嘉诚医学院解剖学系）

（5.澳门大学中华医药研究院中药质量研究国家重点实验室）

【摘要】目的：研究铁超负荷对鼠神经干细胞的细胞活性、凋亡及ERK磷酸化的影响，探讨钙离子阻滞剂对铁诱导鼠神经干细胞损伤的保护作用。方法：采纳小鼠神经干细胞系C17.2细胞及大鼠胚胎海马神经干细胞为细胞模型。XTT比色法检测细胞活性。AnnexinV/PI,活化caspase-3及线粒体膜电位(JC-1)流式细胞仪检测细胞凋亡。抗-磷酸化-ERK1/2流式细胞仪检测ERK磷酸化。结果：铁超负荷通过诱导线粒体损伤及Caspase-3活化，以浓度及时间依赖方式（0.15?1.8mmol/L；24&48小时）显著降低鼠神经干细胞活性。临床相关浓度铁超负荷(0.6?0.9mmol/L)还能诱导鼠神经干细胞ERK磷酸化。钙离子阻滞剂（氟桂利嗪或尼莫地平）能减少临床相关浓度铁超负荷所诱导的鼠神经干细胞的ERK磷酸化及线粒体损伤，减轻铁诱导细胞凋亡，显著地改善了细胞活性。结论：铁超负荷诱导鼠神经干细胞ERK磷酸化，经历线粒体介导的凋亡。钙离子阻滞剂可抑制上述过程，减少铁诱导鼠神经干细胞凋亡。

【关键词】铁超负荷；神经干细胞；钙离子阻滞剂；细胞外信号调节酶（ERK）

【中图分类号】R363【文献标识码】A【文章编号】1004-6194（2015）01-0088-03

【Abstract】Background:Excessiveironaccumulationinthebrainwithoxidativedamagehasbeenobservedinneurodegenerativedisordersandhemorrhagicstroke.Objectives:Tostudytheinfluenceofiron-overloadoncellviability,apoptosisandERKphosphorylationofNSCs；ToexploretheprotectivepotentialofcalciumchannelblockersonNSCsunderironoverloadedcondition.Methods：ThemurineneuralstemcelllineC17.2cellsandratembryonic(E17.5)hippocampalneuralstemcells(hNSCs)servedasacellmodel.Thepalentortrivalentironcompounds(ferrousammoniumsulfate,ferricchlorideandferricammoniumcitrate),calciumchannelblockers(nimodipineandflunarizine)wereusedinthestudy.XTTcolorimetricmethodwasadoptedtodetectthecellviability.TheAnnexinV/PI,ActiveCaspase-3andJC-1viaflowcytometrywereusedtomeasureapoptoticcells,whileanti-phospho-ERK1/2wasadoptedtodetectERKphosphorylationbyflowcytometry.Results:Ourresultsshowedthatironoverloadsignificantlydecreasedcellviabilityviainducingmitochondrialdamageandcaspase-3activityinadose-andtime-dependentmanner(0.15?1.8mmol/L,24&48hrs).Clinicallyrelevantdosesofiron(0.6?0.9mM)alsoinducedERKactivationofNSCs.Undersuchconditions,calciumchannelblockerscouldsignificantlyimprovecellviabilitybypartiallyamelioratedironinducedapoptosisviapreventingmitochondrialdamage.CalciumchannelblockersalsopreventedERKactivationiniron-overloadedNSCs.Conclusions:Insummary,excessiveironinducedNSCsunderwentmitochondria-mediatedapoptosisandinvolvedERKactivation.Calciumchannelblockerscouldpotentiallyprotectiron-inducedneurotoxicityinNSCsbyinhibitingtheseprocesses.

【Keywords】Ironoverload,Neuralstemcells,Calciumchannelblockers,Neurodegenerativedisorders,Extracellularsignal-regulatedkinases(ERK).

背景

脑中铁超负荷诱导氧化损伤常见于出血性中风[1]，以及神经退行性障碍如帕金森病（PD）及阿尔兹海默病（AD）等[2,3]。铁超负荷对脊髓神经元的毒性作用及干细胞移植后的毒性亦见报道。本研究探讨铁超负荷对鼠神经干细胞的细胞活性、凋亡及ERK磷酸化的影响；钙离子阻滞剂对铁诱导鼠神经干细胞损伤的保护作用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞

小鼠起源多能神经干细胞系C17.2细胞由澳大利亚新南威尔士大学解剖系DavidWalsh博士提供。大鼠胚胎（E17.5）海马神经干细胞(hNSCs)由香港大学解剖教研室提供。

1.1.2主要化学药品

硫酸亚铁胺（FAS），三氯化铁（FC），氟桂利嗪，尼莫地平及U0126购自美国Sigma公司。枸橼酸铁胺（FAC）由香港大学化学系孙红哲教授赠送。

1.1.3主要试剂

试剂盒购自美国BD生物科学公司，包括AnnexinV-FITC凋亡检测盒、caspase-3抗体凋亡检测盒、线粒体膜电位检测盒(JC-1)、抗-磷酸化-ERK1/2检测盒;XTT购自德国Roche公司。胎牛血清购自美国Thermo科学公司；IMDM、DMEM-F12购自美国Gibco公司；胰蛋白酶、B27、N2、bFGF、及EGF购自美国Invitrogen公司。

1.2试验方法

1.2.1细胞培养：

C17.2细胞培养于含10%胎牛血清的IMDM中；hNSCs培养于含DMEM-F12,B27,N2,bFGF,及EGF中。EGF及bFGF每24小时补充，培养基每2天换1次保证细胞保持在非分化及增殖状态，头5代hNSCs用于当前试验；培养条件为37。C、5%CO2，且饱和湿度。

1.2.2XTT比色法分析细胞活性

根据制造商指引，一个小份(50?l)XTT标记的混合物加入每个孔，在37。C、5%CO2且饱和湿度的条件下培养4小时后，测定A值，测量波长450nm。

1.2.3AnnexinV/PI,活化caspase-3及线粒体膜电位(JC-1)分析凋亡细胞死亡

根据制造商指导，使用AnnexinV/PI,活化caspase-3及线粒体膜电位(JC-1)使用美国CoulterEpicsElite流式细胞仪分析凋亡细胞死亡。使用WinMDI2.9软件分析。

1.2.4抗-磷酸化-ERK1/2分析ERK磷酸化

根据制造商的指引，使用抗-磷酸化-ERK1/2使用美国CoulterEpicsElite流式细胞仪分析ERK磷酸化。使用WinMDI2.9软件分析。

1.3统计分析

使用SPSS17.0版本进行统计分析。使用Kruskal-Wallisranking检验及posthoc比较，采用Mann-Whitney检验。p<0.05考虑两者之间存在统计上显著不同。

2结果

2.1铁超负荷减少C17.2细胞活性

XTT分析发现外源性铁(FAS,FC或FAC)以浓度(0.15?1.8mM)及时间[24(A)及48hrs(B)]依赖模式显著地减少细胞活性(n=3;Kruskal-Wallistest:p<0.001针对FAS,FC或FAC,24或48小时;Mann-Whitneytest:***P<0.001针对FC;###p<0.001针对FAS及^^^p<0.001针对FACvs对照组)。虽然，24小时FAC（0.3mM)组的细胞活性存在显著增加(A;n=3;Mann-Whitneytest:^p=0.05vs对照组)。每一点代表三次独立试验的均数?标准差。

3讨论

临床上已发现毫克分子量的铁可沉积在神经斑,神经纤维缠结以及脑血肿当中。已分化神经细胞暴露在过量的铁当中能够导致浓度依赖的脂质过氧化反应，发生凋亡[5]。铁超负荷对神经干细胞神经毒性作用，及钙离子阻滞剂对铁诱导神经干细胞损伤的保护作用的研究尚未见报道。

3.1铁超负荷诱导神经干细胞凋亡

本研究探讨与临床相当浓度的铁（0.6?0.9mmol/L）诱导神经干细胞损害的情况。研究发现铁超负荷能够以浓度及时间依赖模式通过线粒体介导内源性通路诱导神经干细胞凋亡，减少细胞活性。本研究还发现提前给予泛caspase抑制剂z-VAD-fmk可显著减少铁超负荷C17.2细胞凋亡细胞死亡（未发表数据）,进一步确认caspase在铁诱导神经干细胞死亡当中所扮演的关键角色。研究尚发现在体外，二价铁(FAS)较三价铁(FCorFAC)具有更强的神经毒性作用。这可能与二价铁具有更强的过氧化潜力有关。

3.2钙离子阻滞剂减少铁诱导神经干细胞的凋亡

在铁超负荷情况下，L型钙通道部分地负责过量铁的进入。许多具有潜在兴奋类型的细胞具有L型钙通道。Cav1.2基因(旧称?1C)可在各种各样细胞包括神经细胞中表达。我们的研究发现Cav1.2基因的mRNA(158bp针对hNSCs及356bp针对C17.2细胞)以及它的相关蛋白在本研究所采用的神经干细胞模型当中表达(未发表数据)。氟桂利嗪是苯基哌嗪衍生的钙离子阻滞剂，可阻止L-，N-，及T-型钙通道。它还具有适度的多巴胺受体拮抗体活性。尼莫地平，是1.4-二氢吡啶的成员,是相对特异性的L-型钙离子阻滞剂。二者皆可通过血脑屏障。

二价铁能够与钙离子竞争进入老鼠的嗜酪细胞瘤PC12细胞系及小鼠神经母细胞瘤N-2?细胞系[4]。有研究[6]发现阻断L-型钙离子通道能够保护铁诱导海马及黑质神经元神经毒性。本研究发现，给予钙离子阻滞剂尼莫地平或氟桂利嗪皆能够改善铁超负荷情况下神经干细胞的活性。这种保护作用表现为减少了铁诱导的线粒体损害,凋亡及caspase-3的活化。对比这两个钙离子阻滞剂，尼莫地平的作用似乎更强大。推测原因，可能因为它是特异性的L型钙离子通道阻滞剂。然而，本研究钙离子阻滞剂有益的作用，也可能是因为其他混淆的因素或机制。例如，钙离子阻滞剂能够阻止钙离子内流到细胞，具有抗氧化的特性。此外，对氟桂利嗪而言，它还能够阻断T/N型钙离子通道或多巴胺受体。

在神经退行性障碍早期阶段，通过发展有效的神经保护治疗，减缓或终止其进程，是一个最终的目标之一。本研究表明钙离子阻滞剂也许能够帮助那些具有细胞内铁沉积风险的出血性中风或神经退行性障碍的患者,虽然钙离子阻滞剂也许因为其他相关的临床适应症，已经被用在这些疾病当中。

3.3抑制ERK磷酸化保护铁诱导神经干细胞的神经毒性

ERK激活已被发现能够造成细胞的死亡,因为MEK或ERK抑制剂在与过氧化损伤相关联的非神经细胞或神经细胞的损害当中已被发现具有保护作用。而且,MEK抑制剂对缺血或创伤的神经元具有神经保护作用。通过MEK抑制剂U0126抑制ERK激活[7]或ERK抑制剂[7]能够减少亚铁血红素介导的皮层神经元的损伤。

研究发现过量的铁导致ERK激活，随后发生神经干细胞凋亡。不同种类不同剂量铁复合物的暴露，可呈现不同的ERK激活模式。它们能够被分类成快速的，持续的或迟发的模式。模式的不同主要与所使用铁复合物效力相关。ERK快速激活也在淀粉样蛋白-β多肽及铁诱导神经细胞当中发现[8]。此外，我们的研究还发现不同的神经干细胞类型也具有不同的ERK激活模式，即便它们被暴露在相同的铁复合物当中。此外，二价铁(Fe2+)(FAS)及三价铁(Fe3+)(FC)具有近似均等针对C17.2细胞ERK激活能力，也许表明二价及三价铁在细胞内转换的现象。

3.4钙离子阻滞剂减少铁诱导神经干细胞的ERK磷酸化

本研究发现钙离子阻滞剂（尼莫地平或氟桂利嗪）能够减少铁诱导ERK磷酸化水平，保护铁诱导神经干细胞的神经毒性。本研究发现MEK抑制剂(U0126)也能够减少铁诱导ERK磷酸化水平，同时也能够增加铁超负荷神经干细胞的活性(未发表数据)。

在铁诱导神经干细胞细胞毒性作用当中，ERK活化与凋亡之间存在因果关系的关联。ERK活化发生在早期，而细胞死亡发生在更后阶段，表明ERK是一个上游信号负责铁诱导神经干细胞死亡。这些数据支持ERK通路是铁诱导神经干细胞凋亡关键通路的推测。

4结论

铁超负荷导致过氧化损害及神经干细胞凋亡。这样的损害通过活化ERK信号级联放大及随后触发了内源性的凋亡通路。在铁超负荷的状态，L-型钙离子通道也许负责铁离子进入神经干细胞，而钙离子通道阻滞剂能够显著地阻断过量的铁进入，通过改善铁诱导凋亡，改善神经干细胞活性。在铁超载的神经干细胞当中，钙离子阻滞剂能够潜在地阻止ERK磷酸化。未来，应开展体内及临床研究，以验证这些体外研究的发现。

感谢

该研究由香港大学CRCG-HKU研究基金(10207982-08296-21100-323)及HotungSK基金支持。

参考文献:

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[8]KupersteinF,YavinE.ERKactivationandnucleartranslocationinamyloid-betapeptide-andiron-stressedneuronalcellcultures[J].EurJNeurosci,2002,16:44-54.

通讯作者:

陈志峰，教授，香港大学李嘉诚医学院儿童与青少年系