紫外可见分光光度法在黄酮测定中的应用

紫外可见分光光度法在黄酮测定中的应用

肖逢燕1陈爱民2刘永芬3

肖逢燕1陈爱民2刘永芬3（1江西吉水县人民医院药剂科331603)(2江西中医学院基础医学院330004)(3江西中医学院临床技能中心330004）

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2011)01-0220-02

【摘要】黄酮类化合物是广泛存在于植物界的一大类天然产物，种类繁多，大多数黄酮类化合物与葡萄糖或鼠李糖结合成苷，部分为游离态或与鞣质结合存在。近年来，黄酮类化合物以其广谱的药理作用倍受青睐，人们对含有黄酮的化合物进行大量研究，以期获得黄酮含量较高的中草药，黄酮的含量测定成为研究的关键步骤。

【关键词】紫外可见分光光度法黄酮测定

黄酮类化合物是广泛存在于植物界的一大类天然产物，种类繁多，大多数黄酮类化合物与葡萄糖或鼠李糖结合成苷，部分为游离态或与鞣质结合存在。黄酮化合物系色原烷或色原酮的2-或3-苯基衍生物，一般具有C6-C3-C6的基本骨架结构。近年来，黄酮类化合物以其广谱的药理作用倍受青睐，人们对含有黄酮的化合物进行大量研究，以期获得黄酮含量较高的中草药。因此黄酮的含量测定成为研究的关键步骤。

1紫外—可见分光光度法在药物分析中的应用

紫外可见分光光度法以其设备简单、适用性广、准确度和精密度较好等特点，已在中药总黄酮含量分析中发挥着重要作用，并已经成为应用最广泛的分析手段之一[1]。据统计，在药物分析中，分光光度法占29.1%，色谱法占25.5%，荧光、化学发光法占2.4%，与光度法有关的方法共计占31.5%，由此可见，光度法是药物分析最常用的方法之一[2]。研究结果表明，光度法在药物分析中的可靠性可以和色谱法相媲美，但其设备简单、操作方便、价格低廉、易于普及等特点是色谱法难于做到的[3]。

2紫外—可见分光光度法在黄酮类化合物中的应用

紫外可见分光光度法是利用某些物质的分子在200～800nm光谱区的吸光度来进行分析测定的方法。一般以中草药、中药制剂自身所含的黄酮类化合物作为对照品，在紫外区或经显色后在可见光区，选择对照品的最大吸收波长处进行测定[4]。中草药的成分十分复杂，在进行黄酮含量测定时要根据具体条件选择适当方法。

2.1直接扫描测定

尽管黄酮类化合物种类繁多，但其基本母核为2—苯基色原酮，都具有C6-C3-C6的结构，因此，多数黄酮类化合物存在两个特征吸收，即在300～400nm区间由B环桂皮酰基系统电子跃迁引起的带I和在240～285nm之间由A环苯甲酰基系统电子跃迁引起的带Ⅱ。约有6％的文献采用供试品溶液与对照品溶液通过紫外光谱扫描在以上区间获得共有吸收作为检测波长进行含量测定。韦英杰[5]等采用化橘红中成份柚皮苷为对照品，经扫描，供试品溶液和对照品溶液在283nm处均有最大吸收，因此，确定283nm为化橘红总黄酮含量测定的检测波长。

2.2比色法在黄酮中的应用

比色法研究中，我们常向供试品中加入显色剂后测定吸光度以测定其含量，这种紫外可见分光光度的方法又称为比色法。黄酮类化合物普遍存在于植物中，至今已证实结构的化合物有2000多种。据文献报道，黄酮类化合物分子中若具有3-羟基、5-羟基或邻二酚羟基，则易于与金属盐类如铝盐、锆盐、锶盐、镁盐等反应，生成有色金属络合物，这些络合物作用在光谱上能产生明显的变化，吸收峰红移。常用于黄酮类化合物含量测定的金属盐试剂有Al(NO3)3、A1C13等。

2.2.1与A13+的络合反应

张公亮[6]等以1％A1cl330％乙醇溶液为络合剂，经10min络合反应后于420nm处测定吸光度值，以芦丁表示仙人掌中总黄酮含量。齐曼丽[7]等以槲皮素为对照品，精密加入5％A1C13，乙醇溶液2mL，放置20min后于415nm波长处测定吸光度值，计算五味沙棘冲剂中总黄酮含量。而席荣英[8]等对半枝莲中总黄酮的测定，采用的络合试剂为4％A1(NO3)3溶液，对照品为芦丁，以芦丁和样品的铝络合物测定液的共有最大吸收波长271nm为检测波长进行定量分析。而A1C13比色法与A1(NO3)3比色法类似，即以A1C13为络合剂，在非碱性条件下络合显色，生成黄色螯合物进行比色测定。刘春宇[9]等采用A1C13对沙苑子总黄酮的含量进行了测定，得总黄酮含量为21.5mg·g-1。丁明玉[10]等以贯叶金丝桃为研究对象，对总黄酮含量测定的几种分光光度法进行了比较研究，最终采用A1C13比色法，总黄酮的得率为36.4％。

2.2.2在醋酸—醋酸盐溶液下与Al3+的络合反应

席先蓉[11]等和张进棠[12]等分别以芦丁和槲皮素为对照品。在pH=5.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液和醋酸一醋酸钾缓冲溶液(pH=5.5)的条件下，均加入0.1mol·L-1A1C13溶液。其最大吸收波长均在272nm处。郭素华等则在1.0mol·L-1醋酸钠-1．0mol·L-1醋酸(3：1)溶液条件下，加入0.1mol·L-1A1C13溶液，在430nm处测定吸光度值，以槲皮素计算养心草的总黄酮含量。

2.2.3在醋酸钾或醋酸钠条件下的络合反应

A1(NO3)3比色法是一些药典最常用的总黄酮含量检测方法，它主要以A1(NO3)3为显色剂，在碱性条件下，利用其与黄酮形成红色螯合物为特征，以芦丁为对照品，在510nm处测定其吸收度，从而得到待测物质的黄酮含量。穆赫塔尔·伊米尔艾山[13]等在芦丁对照品溶液和样品溶液中加入0.1mol·L-1A1C13，溶液和1.0mol·L-1醋酸钠溶液，50％乙醇溶液定容，放置40min后，于420nm处测定，计算心草中总黄酮含量。杜薇等[14]则在测定液中加入2.5％A1C13溶液和10％醋酸钾溶液。放置40min后，同样于在420nm处测定，以芦丁表示刺梨中总黄酮含量。刘斌[15]等就采用这种方法对蒲黄总黄酮的含量进行了测定，得率为1.7％。蒋惠娣[16]等测得的杭白菊的含量为8.07％。

2.2.4NANO2-Al(NO3)3-NaOH反应条件

文献报道中有76％的研究采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH反应方法，孙佩霞[17]等采用正交试验设计，对5％NaNO2、10％A1(NO3)3、4％NaOH溶液在反应过程中的用量进行考察，结果表明在测定液的反应过程中加人5％NaNO2溶液0.3mL，摇匀，放置6min，10％Al(NO3)3溶液0.3mL，摇匀，放置6min，4％NaOH溶液4mL，摇匀，放置10min后，在500nm波长处测得吸光度值最大。但郭亚健[18]等选择了一些黄酮类成份和非黄酮类成份，按上述方法在波长400—700nm范围内进行扫描测定，结果表明黄酮类成份黄芩苷、黄芩素、香蒲新苷、山奈酚、槲皮素、橙皮苷等在500nm左右无最大吸收或吸收较弱，而非黄酮类成份咖啡酸、原儿茶醛、绿原酸、原儿茶酸在500nm左右有最大吸收或吸收较强，香草醛、阿魏酸等也有一定吸收，说明以芦丁为对照品，以NaNO2-A1(NO3)3-NaOH为显色剂在500nm进行总黄酮含量测定的方法专属性不强。同时，也表明化合物是否具有邻二酚羟基结构可能与此条件的显色反应有关。

3结语

在利用紫外分光光度法对天然植物黄酮类化合物含量测定的方法研究中，通过对有关文献的归纳分析，得到以下几点认识：对照品的使用主要有以下两种方式：(1)测定对象本身所具有的；(2)测定对象本身的化学成份不明确、不易获得或无合适对照品，则总黄酮含量常以芦丁或槲皮素表示。测定波长存在差异的可能原因：(1)被测物结构差异；(2)反应溶媒差异；(3)反应条件差异；(4)仪器性能差异。

尽管使用紫外分光光度法测定总黄酮含量的方法由于专属性不强，未必能全面客观地反映测定对象的真实情况，但对成份复杂的天然植物来说，在未获得准确可靠的分析方法时，紫外分光光度法仍不失为一种可供借鉴的总黄酮含量测定方法。

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