梅毒实验室检测方法的研究进展

梅毒实验室检测方法的研究进展

陈霭延

（广西梧州市皮肤病防治院广西梧州543000）

【摘要】梅毒是由梅毒螺旋体（TP）引起的慢性、系统性性传播疾病，具有传染性强、潜伏期长、临床表现复杂和危害系数大等特点。近年发病率呈增长趋势，早发现，早诊断、早治疗对控制梅毒的流行十分重要。梅毒的诊断主要依靠实验室检测，TP尚不能进行体外培养，目前梅毒的实验室检测方法有病原学检查、血清学检查和梅毒的核酸检查试验。因此，选择快速、特异性强、敏感性高的试验方法有利于梅毒的早期诊断及治疗。

【关键词】梅毒；实验室检验；病原学检验；血清学检验

【中图分类号】R759.1【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2018）34-0389-03

梅毒是人类独有的疾病，梅毒螺旋体(T.pallidum，TP)是梅毒的病原体，患者是梅毒唯一传染源。梅毒有先天性和获得性两种，前者TP通过胎盘由母体传染胎儿；后者主要经性接触传播，也可经输血引起输血后梅毒。本病病程长，在发展过程中可侵犯任何器官和组织，引起多种多样的症状和体征，甚至危及生命。另外，梅毒作为一个极其容易潜伏的疾病，往往患者患病多年都无非常明显的症状凸显[1]。梅毒的实验室检测包括病原学检查、血清学检查和梅毒的核酸检查三大类。近年来，随着分子生物学和免疫学技术的发展，使得快速、敏感、特异的梅毒诊断方法不断更新完善，有利于广泛开展流行病学调查、预防控制以及指导临床及时治疗，以控制梅毒的传播流行。

1.病原学检查方法

病原学检测及梅毒螺旋体检查，适用于I、Ⅱ期梅毒有病损者的患者。主要有三种方式，暗视野显微镜检查、镀银染色检查以及直接免疫荧光试验（DFA）检查，是诊断早期梅毒首选的方法，孕妇的羊水作暗视野显微镜检查TP，对先天梅毒具有诊断价值[2]。病原学检测有利于早期患者早日确诊，不耽误治疗的有效时间，减轻了患者的痛苦，降低了疾病的恶化率，为后期预防和进一步传播有着十分重要的意义。

1.1暗视野显微镜检查法

临床医学中暗视野显微镜检查法是早期梅毒患者最主要的病原学的检测方法。其原理是显微镜聚光镜中央有挡光片，利用光的散射现象，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。通过硬下疳、扁平湿疣、黏膜斑等皮损部位组织液或淋巴结穿刺术得到的组织液，在暗视野显微镜下检查，见到运动活泼，沿其长轴滚动、屈伸、旋转、前后移行等的螺旋体，可作为梅毒的确诊依据。假若是阴性，需要在3周不同的3日内进行再次采样检测，最终若依旧是阴性才能进行确诊[3]。该检测方法受取材及特殊显微镜限制，准确性受操作者的经验、病灶中活螺旋体的数量以及口腔、肛门破损处存在的非致病性螺旋体等因素的影响。

1.2镀银染色法

从临床意义来看与暗视野显微镜检查法一致。因螺旋体具有亲银性，高倍显微镜螺旋体呈现棕黑色的显像，背景为黄色。

1.3直接免疫荧光法（DFA）

特异性和敏感性均优于暗视野显微镜检查法和镀银染色法，国外临床医学采用较多，直接免疫荧光法，通过异硫氰酸荧光素标记TP单克隆抗体，使得其与TP进行结合后，在荧光显微镜下呈现苹果绿色进行确诊，此法普遍用于区分TP和其他非致病性或条件致病性螺旋体[4]。

2.血清学检查方法

血清学检查法有梅毒螺旋体抗原血清试验和非梅毒螺旋体抗原血清试验两类。

2.1非梅毒螺旋体抗原血清试验

非梅毒螺旋体抗原血清试验的以类脂质作为抗原，测定病人血清中反应素（抗脂质抗体）。从临床医学划分此试验主要有四种，原理基本相同[5]，（1）性病研究实验室玻片试验（VDRL）：其原理以胆固醇为载体，包被上心脂质构成VDRL颗粒，与血清中的反应素结合后出现现凝集反应，结果需要低倍显微镜观察。脑脊液VDRL试验是神经梅毒可靠性诊断依据。此方法待检样品需经56℃灭活，试剂需要现场配制，即配即用，存在相应的局限性，此类方法国内的采用的较少。（2）不加热血清反应素试验（USR）：是VDRL抗原的改良，即将VDRL抗原用稀释液稀释后离心沉淀，于沉淀中加入EDTA、氯化胆碱和防腐剂，敏感性及特异性与VDRL相似。EDTA可使抗原在半年内不变性，氯化胆碱可灭活补体等，使用血清可不必加热灭活。抗原不必每天配制，在4～8℃冰箱中可保存半年。此种试验虽然没有较高的要求，但是现今较少使用。（3）快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）：也是是改良的VDRL实验，其原理使用未经处理的活性炭颗粒（直径3～5um）吸附VDRL抗原。此颗粒如与待检血清中的反应素结合，形成肉眼可见的黑色凝集块。（4）甲苯胺红不加热试验（TRUST）：以更易观察的红色甲苯胺红作为辅料进行试验，最终结果更易辨识。

2.2非梅毒螺旋体抗原血清试验的缺陷

（1）特异性：某些疾病例如麻风、结核、传红斑狼疮、类风湿性关节炎等的患者，皆会出现与梅毒类似的反应素，在进行试验时会出现假阳性反应，对最终确诊带来干扰[6]，特异性较差。（2）敏感性：当感染梅毒螺旋体后机体特异性梅毒螺旋体抗体要早于反应素出现，使得一期梅毒的漏检率较高，增加了患者病情恶化的系数[7]。另外晚期梅毒患者的反应素转阴率较高，再加上这类试验不利于隐性梅毒的确诊，对于梅毒进行筛选排查的漏检率高。

2.3非梅毒螺旋体抗原血清试验的优点

若已确诊为阳性患者，对于临床开展工作有较好的时效治疗性；非梅毒螺旋体抗原血清试验可以有效的作为疗效观察的指标，来观察患者梅毒病症的发展；此类方法所用费用较低，减轻了患者的医疗费用负担[8-9]。

2.4梅毒螺旋体抗原血清试验

用活的或死梅毒螺旋体作为抗原测定血清中抗螺旋体IgM和/或IgG抗体，其敏感性和特异性优于非梅毒螺旋体抗原血清试验，但不能用于疗效观察。梅毒螺旋体抗原血清试验一般采用以下几种方法[10-11]：（1）荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）；（2）梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）；（3）梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）；（4）梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）；（5）梅毒螺旋体化学发光免疫测定（TP-CLIA）；（6）梅毒螺旋体快速诊断试验（TP-RT）；（7）梅毒螺旋体免疫印迹法（WB）。

2.5荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）

FTA-ABS是一种间接荧光抗体法。试验前先用Reiter密螺旋体超声波裂解物处理待检血清，以去除非特异性类属抗原，再与TP作用，然后加用荧光素标记的羊抗人丙种球蛋白，在荧光显微镜下观察，是否有荧光的TP，从而检测有无特异性抗体。FTA-ABS誉为检测梅毒的“金标准”，敏感性和特异性在所有螺旋体试验中尤为突出[12]。但是，此试验操作相对较难，对于操作人员的职业技能要求较高，一般用于筛选实验阳性标本的确诊实验。

2.6血球凝集试验、明胶凝集试验

梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）以超声裂解的TP为抗原，由此致敏红细胞与人血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体结合，进而产生反应进行检测。若进行大样本批量检测时，TPHA优于FTA-ABS[13-14]。缺点：需主观判断结果，主观性较高。梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）在TPHA基础上进行升级，将梅毒螺旋体Nichols株的精细菌体成分包被在人工合成的惰性明胶颗粒取代TPHA中的红细胞作为进行试验的载体。TPPA包含了梅毒螺旋体的所有片段，敏感性更高，结果更易观察。TPHA试剂保存时间短，批间差大，TPPA试剂稳定性、特异性、敏感性和批间差均优于TPHA。

2.7梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）

2.7.1TP-ELIS通过TP抗原包被聚丙乙烯板，再加入待检血清以及酶标记抗原，形成双抗原夹心，同时检测1gG和IgM抗体[15]。敏感性和特异性就较高，影响因素少，可采用自动化操作，费用较低廉，因此临床上常用于大量样品的筛查和临床诊断。

2.7.2酶联免疫吸附试验检测梅毒螺旋体IgM抗体，该试验采用间接法或捕获法。以捕获法的敏感性和特异性为佳。由于血液中IgG的量高于IgM，为避免交叉反应所引起的假阳性，需对样本进行预处理，除去其中的IgG再进行IgM测定。分离去除1gG的常用方法为以抗人IgG等为沉淀剂的柱层析法或免疫沉淀法。酶联免疫吸附试验检测梅毒螺旋体IgM抗体一般用于先天性梅毒的诊断，活动性梅毒（新近感染）的诊断及疗效观察，梅毒再感染的诊断[16]。

2.8梅毒螺旋体化学发光免疫测定（TP-CLIA）

TP-CLIA是新近发展的一种体外快速诊断技术，其原理与ELISA方法基本相同，只是以化学发光底物取代了发色底物，检测的信号则由光密度（A值）变为光子数，较之ELISA方法，其分析敏感性更低，可报告范围更宽[17]。

2.9梅毒螺旋体快速检测试验（TP-RT）

TP-RT多数用于紧急和实验条件欠佳的场合，在临床应用中多采用胶体金进行标记，同时检测IgG、IgM抗体或单测IgG抗体。无需高精端仪器，试验过程简单快速，但测定结果受温度和时间影响较大。

2.10梅毒螺旋体免疫印迹法（WB）

WB将TP-Nichols株菌体细胞破碎，使用凝胶电泳将梅毒螺旋体各种抗原成分转印到膜条上作为固相，膜条与待测血清和酶标抗体孵育，底物显色后，当血清中存在梅毒特异性抗体时，则在印迹膜上相应的特异性多肽抗原位置出现显色条带。该方法特异性强，敏感性高，很少出现假阳性和可疑反应是理想的梅毒确认实验[18]。但试剂价格昂贵，该方法在基层医疗机构还未广泛推广应用。

3.其他方法

聚合酶链反应（PCR）：梅毒PCR检测方法分为常规PCR，巢式PCR、逆转录PCR，多重PCR和实时PCR。能对生殖器溃疡进行早期鉴别诊断。PCR是直接检测TP-DNA，PCR检测尤其适用于微量TP的检测，其检测的敏感性和特异性均高于血清学试验，缺点是假阳性较高。此外，有将PCR用于孕妇产前诊断和神经梅毒诊断的报道[19-20]。PCR的设计主要针对编码梅毒螺旋特异性抗原和TpN47的DNA开放编码区，由于PCR的非特异性、TpN47的保守性，这种设计的PCR虽然不能区分梅毒和雅司；但可区分梅毒螺旋体和引博氏疏螺旋体。逆转录PCR是针对梅毒螺旋体的16srRNA366bp片段的设计，其污染少，特异性和敏感性高，但是检验费用稍高。

4.小结

结合上述相关资料显示可知，在梅毒试验中由于受到方法学自身的局限性、患者自身状况的特殊性、实验器材以及相关因素的影响，无论何种梅毒检测方法，在进行标本检测时，都具有相应的误差，此种误差暂时无法避免，另外在结果判读时，假阴性或假阳性情况的出现亦有存在。综合分析血清学检测检测方法仍是临床上梅毒实验诊断的主要方法。多年来通过大量的研究工作，建立了许多检测TP的方法。随着分子生物学技术发展，聚合酶链反应和免疫印迹技术为梅毒的诊断提供了新的检测手段。未来针对梅毒的检测技术，必将朝着快速、简便、低成本、高检测率的方向推进。

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