8种烈性中药的体外急性毒性试验方法初探

8种烈性中药的体外急性毒性试验方法初探

陈素珍李瑾翡曾秋敏

陈素珍李瑾翡（通讯作者）曾秋敏

（广东省食品药品检验所510180）

【摘要】目的比较两种体外细胞毒性方法，探讨其用于预测中药急性毒性的可能性。方法应用3T3细胞中性红摄取实验、MTT实验检测8种烈性中药的细胞毒性，将测得的IC50值分别与急性经口毒性试验的小鼠LD50值进行比较。结果3T3细胞MTT、中性红2种检测方法中,以MTT法的检测结果与体内LD50的相关性较好。结论与3T3细胞中性红法相比，MTT法可较好地预测烈性中药的急性毒性，有望用于中药急性毒性的初筛实验。

【中图分类号】R28【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）22-0044-02

急性毒性试验是毒理学安全性评价的首个基础性工作，传统的急性毒性试验由于实验周期长、使用实验动物多，耗费人力物力大，越来越不能适应当前现状。且随着动物伦理和“3R”原则的贯彻实施，体外替代实验成为当今研究工作的热点。已有研究表明，化学物质的体外细胞毒性实验与整体动物实验结果有很大的相关性，有望用于化学物质急性毒性筛查[1]。本研究旨在探讨体外细胞毒性方法用于预测中药急性毒性的可能性。

1.材料与方法

1.1试剂与仪器

8种烈性中药受试物：附子、炮附片、牵牛子、山豆根、雷公藤、制草乌、姜半夏、苦楝皮中药配方颗粒均为由某有限公司提供。

RPMI1640培养基（GIBCO公司）；胎牛血清（杭州四季青）；MTT（广州威佳）；中性红染料（广州威佳）。

M2E多功能酶标仪；OLYMPUS正置显微镜。

1.2溶液配制

进行动物实验时，将受试物用打粉机打碎至细粉，加温纯化水不断研磨至完全溶解；进行细胞实验时，用PBS溶解受试物，经0.22um滤膜滤过后备用。

1.3实验动物

体重为18g～22g的NIH小白鼠，雌雄各半，共220只，由广东省医学实验动物中心（实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2008-0002）提供，合格证号：0109340。本所实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2009-0050。

动物购进后先在实验动物房饲养2天，动物饲养室温度22℃-25℃，相对湿度60%-70%，观察合格后进行正式实验。

1.4细胞及其培养条件

BALB/c3T3（小鼠胚成纤维细胞）购自中国科学院上海细胞库，细胞接种于25cm2的细胞培养瓶中，用含10%FBS的RPMI1640培养基在37℃、5%CO2的条件下进行常规培养。当细胞长至对数生长期时，用0.25%胰酶进行传代或接种于96孔细胞培养板进行实验。

1.5动物体内急性毒性实验

试验前动物禁食12小时，不禁水。试验时按性别、体重将小鼠随机分组，雌雄各半。试验当天受试物组小鼠灌胃给予相应受试物，给药剂量见表1，对照组灌胃给予等体积纯化水，给药后观察小鼠毒性反应情况，连续观察14天。若动物未发生明显毒性反应，则按最大耐受量法计算该受试物的最大耐受量；若动物发生死亡，则另取实验动物，进行LD50实验，根据实验结果计算药品的LD50值。

1.63T3细胞中性红摄取实验

取对数期生长的3T3细胞按1*105个/ml接种于96孔板，37℃，CO2培养箱中培养过夜使贴壁。用含5%FBS的RPMI1640培养基配制系列溶度受试物。最高浓度为200mg/ml，以1:2梯度往下稀释7个浓度，每个浓度3个平行孔，每孔加100uL受试物孵育24h，对照孔加100uL的培养基。染毒结束后，加150uL/孔预热PBS溶液冲洗2次，再加100ul中性红培养液（1ml25%中性红溶液+49ml含5%FBS的培养基），孵育3h后，用PBS溶液冲洗2次，再加150ul/孔中性红解吸附液（含1%冰醋酸、49%三蒸水和50%无水乙醇），震荡10min（避光）后于酶标仪上读取540nm波长下的吸光度，实验重复2遍。

1.73T3细胞MTT实验

按1.6项方法接种、染毒，染毒结束前4h后，加20uL/孔MTT溶液。孵育4h后，移除上清液，加150ul/孔DMSO溶液，震荡10min（避光）后于酶标仪上读取490nm波长下的吸光度。实验重复2遍。

1.8数据处理

细胞死亡率计算公式：细胞死亡率（%）=（阴性对照吸光度-受试物吸光度）/阴性对照吸光度。

GraphPadPrism软件计算LD50和IC50值。

2.结果

2.1动物体内毒性实验结果

实验结果详见表1，如表1所示，牵牛子、山豆根、雷公藤、制草乌、姜半夏、苦楝皮这6种中药配方颗粒按最大耐受量法进行急性毒性实验，均未测出LD50，当给药剂量相当于人临床用量的655-2211倍时，实验小鼠均未出现异常。

而附子（黑顺子）中药配方颗粒小鼠灌胃给药的半数致死量LD50为18013.4mg/kg，95%的可信限为16127.4mg/kg～20281.5mg/kg；炮附片中药配方颗粒24小时给药量≥26668mg/kg时，小白鼠死亡率为100%，24小时给药量≤13332mg/kg时，小白鼠死亡率为0%；

2.23T3细胞中性红摄取实验结果

中性红摄取实验测定的8种烈性中药IC50值见表1：由表1所示，由3T3细胞中性红摄取实验所测得的附子、炮附片IC50值分别为27.16mg/ml、11.74mg/ml，高于牵牛子等其他6种中药配方颗粒，与体内动物毒性实验结果不太相符。

2.33T3细胞MTT实验结果

3T3细胞MTT实验测定的8种烈性中药IC50值见表1。由表1所示，动物体内实验毒性较大的附子、炮附片中药配方颗粒经由MTT实验测出的IC50值明显低于动物实验未能测出LD50的其它6种中药配方颗粒，3T3细胞MTT实验结果与动物实验结果表现出一定关联性。

表13种实验方法测试8种烈性中药的急性毒性结果

3讨论

急性毒性试验是毒理学安全性评价的第一步工作。但传统急性经口毒性试验至少需用40只动物，一个实验周期为14天，使用动物多、周期长、耗费的人力物力大，并且以动物死亡为观察终点。近年来，随着动物伦理和动物福利的越来越受重视以及“3R”原则的提出，急性毒性试验的体外替代方法成为研究热点。

急性毒性实验的体外替代方法旨在利用离体细胞或培养组织来代替活体动物实验，研究表明体外细胞毒性和整体动物的急性毒性之间存在良好的相关性[2，3，4]。美国国家毒理学替代方法评价中心提出，小鼠成纤维细胞中性红摄取试验有望用于化学物质急性毒性筛查[1]。还有相当一部分研究验证了中性红摄取试验、乳酸脱氢酶释放试（LDH）验等体外方法用于筛查化学物质急性毒性的可能性[5，6]。但有关中药的体外急性毒性替代方法尚未见报道。

中性红摄取实验、MTT实验是两种常见的体外细胞毒性方法。其中，中性红细胞毒性试验是一种反映细胞存活率的化学敏感性试验。中性红可将活细胞溶酶体染成红色，而死细胞不变色，渗入活细胞的中性红的量与活细胞数量呈正比。该方法具有良好的稳定性及预测能力，已被推荐作为化学物质细胞毒性测试的常用方法。但在本文中，该方法用于预测烈性中药的毒性时，所得的结果与体内动物结果差异较大。可能是由于大部分中药均带有很深的颜色，细胞染毒后药物自身的颜色渗入到细胞内，且该方法实行过程中多次PBS清洗流失部分活细胞，均对最后的吸光度结果造成影响。

MTT实验具有简单、快速、经济和无放射性污染等特点，已成为细胞领域的常用方法。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下生成蓝色不溶于水的甲臜，甲臜生成量与活细胞数成正比，可根据吸光度推测出活细胞数目。

本文将MTT法用于中药的体外毒性测试，实验结果表明：MTT法的实验结果与整体动物急性毒性结果存在一定相关性。而且，大部分中药在进行整体动物急性毒性实验时，常常遇到因为溶解度太小，影响灌胃量而无法准确获得LD50的情况，若能用MTT法替代（细胞实验所需的起始浓度低，灵敏度高），则能较好的解决这方面的问题。

MTT法方便快捷且无需使用活体动物，若能将其用于急性毒性试验的初筛，从而确定动物实验的初始剂量，将大大减少实验周期和动物使用数量，更好的贯彻“3R”原则。未来能否将其作为中药体外急性毒性筛查仍需进一步实验验证。

参考文献

[1]HoffmannS，Kinsner-OvaskainenA，PrietoP，etal.Acuteoraltoxicity:Variability，reliability，relevanceandinterspeciescomparisonofrodentLD50datafromliteraturesurveyedfortheACuteToxproject[J].RegulatoryToxicologyandPharmacology，2010，1-13.

[2]KingAV，JonesPA.In-houseassessmentofamodifiedinvitrocytotoxicityassayforhigherthroughputestimationofacutetoxicity[J].Toxicologyinvitro，2003，17(5-6):717-722.

[3]BallsM,BlaauboerB,BrusickD,etal.ReportandrecommendationsoftheCAATPERGATTworkshoponthevalidationoftoxicitytestprocedures.ATLA,1990,18:313

[4]EkwallB,ClemedsonD,BarileF,etal.Comparisonbetweenhumanskinirritancyandinvitrocytotoxicityfrom77systemsforthefirst12MEICchemicals.InvitroToxicol,1994,7(2):156

[5]曾丽海，赵敏，杨杏芬，等.应用3T3细胞中性红摄取试验预测化学物质急性毒性的探讨[J].毒理学杂志，2011，25（6）：438-440.

[6]王征，张天宝，等.急性毒性体外筛选方法的比较[J].卫生研究，2006，35（3）：286-288

基金项目：广东省科技厅重点引导项目（2010B060500022）