喉癌细胞株HEP-2中叶酸受体表达的实验研究

喉癌细胞株HEP-2中叶酸受体表达的实验研究

陈燕1熊正宁1陈鸿雁2

陈燕1熊正宁1陈鸿雁2(1荣县人民医院四川荣县643100；2重庆医科大学附属第一医院400016)

【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2013)26-0220-02

【摘要】目的探讨喉癌细胞株HEP-2中叶酸受体的表达情况。方法以PBS液作为空白对照，采用免疫组化法对分别检测α型叶酸受体及β型叶酸受体在喉癌细胞株HEP-2中的表达情况。结果喉癌细胞株HEP-2特异性高水平的表达α型叶酸受体，非β型叶酸受体。结论叶酸受体有望成为治疗喉癌治疗的一个新靶点，值得进一步探索。

【关键词】叶酸受体喉癌细胞株HEP-2

喉癌给人类造成了重大的危害，长期以来研究怎样早期诊断及治疗喉癌一直是医学上的研究热点，除了常用的药物化疗、放射治疗和手术治疗之外，各种新的方法不断出现，如免疫疗法、光动力疗法和基因治疗法等，光动力疗法是根据卟啉衍生物的光敏特性，把它们注入体内，利用光照下产生的氧自由基Ⅸ破坏癌细胞组织，以杀死癌细胞，但存在杀伤效率较低，选择性差等问题.常用的药物疗法、放射疗法也会伤害癌细胞周围的正常细胞，造成有害影响，近年来靶向技术因其能减轻对正常细胞的危害而受到广泛重视，本研究为喉癌的靶向治疗提供可能的实验依据。

1材料和方法

1.1材料和仪器

喉癌细胞株HEP-2由本实验室常规保存。α型叶酸受体单抗(MOV-18)购于晶美生物工程有限公司，β型叶酸受体单抗获赠于日本鹿儿大学，SP-9000免疫组化试剂盒购于北京中杉生物有限公司。

1.2实验方法

细胞的复苏：从液氮罐中取出冻存管，置于37℃水浴箱中，轻轻摇动使细胞在1min内解冻。将细胞悬液转入离心管中，加入6mlRPMI-1640培养基，离心800rpm/min后去上清。加入2mlRPMI-1640培养基重悬细胞，转入培养瓶中，另加入6mlRPMI-1640培养基置CO2孵箱中培养。

细胞培养：喉癌细胞株HEP-2用含10%新生小牛血清RPMI-1640培养基培养，于37℃、含有5％CO2培养箱中培养传代，选用对数生长期细胞实验。

免疫组化染色：将喉癌细胞爬片固定，热修复处理后，以PBS液代替一抗作为空白对照组，分别以α型叶酸受体及β型叶酸受体单抗作为一抗进行细胞免疫组化染色(SP)法，具体方案参照SP-9000型试剂盒说明书。

1.3结果判断标准[1]

以细胞膜上呈现棕黄色染色为阳性结果，强阳性为阳性率>90％,阳性为50％-90％,弱阳性为10％-50％，阴性者<10％；以阳性积分光密度(OD)除以面积，取平均值间接反应该标本FRs表达阳性率情况。

2结果

细胞免疫组化染色结果显示，MOV-18组(α-FR组)喉癌细胞膜上均呈现棕黄色染色(见下图)，阳性率90％，为强阳性(>75％)，β型叶酸受体单抗组及空白对照组无着色。说明喉癌细胞膜上高水平表达α-FR。

3讨论

本实验研究发现：喉癌细胞株HEP-2细胞膜上表达α型叶酸受体，表达的阳性率90％，而不表达β型叶酸受体，说明喉癌细胞株HEP-2中特异性的表达α型叶酸受体。

在头颈肿瘤中，AntonyAc[2]等发现，叶酸受体定位于11q13.3-14.1,此位点邻近Int2,而Int2位点为大鼠乳腺肿瘤的病毒螯合位点的人类同源系列。WeitmanSD等[3]发现，叶酸受体编码区域在20%的头颈肿瘤中有扩增。此外,该基因是Bcl-1易位基因t(11;14)(q13;q32)的一个重要位点。此位点包括编码几种生长因子.可能还有细胞周期蛋白的基因.这些基因的表达可能是细胞的转化有关。说明叶酸受体与头颈肿瘤的发生有一定的关系。众所周知，在生理条件下，人体内所需的叶酸必须从外界环境中摄取，而叶酸末端的两个羧基是很难自由通过细胞膜的，为绕过这个屏障，生物体引入了两种机制，一是利用低亲和力的跨膜蛋白直接将叶酸转入胞浆，另一种就是通过高亲和力的糖蛋白受体，即是叶酸受体，通过细胞的内吞作用，将叶酸以氧化物的形式转入细胞内，也是介导叶酸进入细胞的主要途径。首先，叶酸与其靶细胞特异的膜表面受体结合，并富集在靶细胞特定区域(包涵体有衣小凹处)，该区域向胞浆内陷形成胞内体，在酸性(pH5.0～5.5)胞内体中受体与配体分离，受体返回细胞膜表面，而内化的配体或被溶酶体降解，或由此释放入胞液。而叶酸可被还原为四氢叶酸，后者是一碳单位的辅酶，参与一碳单位代谢和嘌呤及胸腺嘧啶的从头合成,当叶酸受体高水平表达的时候,核苷酸的从头合成加快,导致肿瘤细胞的分裂加快,从而加速了肿瘤的发生，发展。利用抗叶酸受体的抗体与叶酸竞争性的结合,阻断叶酸受体将叶酸或叶酸类似物导入细胞内,从而阻止喉癌的发生、发展,从靶向作用的角度，可达到对喉癌的早期诊断及靶向治疗的目的。

可见，本实验提示叶酸受体有望成为喉癌早期诊断及靶向治疗的一个新位点，值得进一步深入研究。

参考文献

[1]MRBusit,CFMMolthoff.DistributionofOV-TL3andMOv18innormalandmalignantovariantissue[J].JClinPathol,1995,48:631-636.

[2]AntomyAc.thebiologicalchemistryoffolatereceptors[J].Blood,1992;79(1):2807-2820.

[3]Weitman.SD,WeinbergAG,ConeyLR.etal.Cellularlocalizationofthefolatereceptor.Protentialroleindrugtoxicityandfolatehomecostasis[J].CancerRes,1992,52(23):6708-6711.