TGF-β1在非酒精性脂肪肝模型大鼠肝脏组织中的表达及意义

TGF-β1在非酒精性脂肪肝模型大鼠肝脏组织中的表达及意义

张敏1,2许翠萍1

张敏1,2许翠萍1

（1山西医科大学第一临床医院消化科山西太原030001；2长治医学院附属和济医院山西长治046000）

【摘要】目的:研究TGF-β1在非酒精脂肪肝大鼠模型肝脏组织中的表达，以探讨TGF-β1在非酒精性脂肪肝发生中的作用，为脂肪肝的临床监测与治疗提供新思路。方法:建立正常大鼠模型（30只），非酒精性脂肪肝模型大鼠（30只），采用免疫组化SABC法测定两组模型肝脏组织中TGF-β1的表达。实验数据的统计方法：计量资料采用单因素方差分析和t检验；计数资料采用χ2检验。结果:在非酒精性脂肪肝大鼠模型肝脏组织中TGF-β1的阳性率高于正常模型肝脏组织，差异有统计学意义（P<0.01）。结论:非酒精性脂肪肝模型大鼠肝脏组织中TGF-β1的表达增加，提示TGF-β1与非酒精性脂肪肝的发生有关。

【关键词】TGF-β1；非酒精性脂肪肝

【中图分类号】R714.3【文献标识码】B【文章编号】1672-2523（2011）05-0004-02

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholicfattyliverdisease,NAFLD）是一种无过量饮酒史、以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。随着人们生活方式及饮食习惯的改变，其发病率正在逐年升高，在世界范围内成为慢性肝病的最常见病因之一。NAFLD的发病机制还不十分清楚,目前被广泛接受的理论是Day和James在1998年提出的二次打击学说。NAFLD各种病因引发脂质代谢异常，FFA和甘油三酯在肝内沉积，通过线粒体和过氧化物酶体β氧化及微粒体ω氧化等途径触发氧应激反应，脂质过氧化反应通过上述机制损伤线粒体，激发机体释放炎症介质和细胞因子，导致肝细胞发生变性、凋亡、坏死和纤维化的发生。因此，炎症介质和细胞因子的产生在非酒精性肝病的发生、发展中居于重要地位。

研究表明,在NAFLD的发生和发展过程中有大量细胞因子产生并参与了疾病的演变过程,其中TGFβ1就是一个重要的细胞因子。但有关TGFβ1在NAFLD的发生、发展过程中具体扮演的角色目前还不清楚,但是已有的数据表明,脂肪肝患者外周血TGFβ1水平明显增高并与疾病的严重程度相关。转化生长因子β1具有调节细胞生长、分化,诱导细胞凋亡,促进细胞外基质形成等多种病理生理功能,是作用最强的胶原合成刺激因子。已有研究证实,TGF-β1在肝细胞的损伤修复以及纤维化形成过程中发挥着重要的作用。

1材料与方法

1.1标本来源实验动物：清洁级雄性Wistar大鼠60只，体重180－220g，由山西医科大学实验动物中心提供。

1.2实验方法

1.2.1实验分组造模Wistar雄性大鼠60只，随机分为两组，正常组30只,模型组30只。对照组：饲以普通饲料和自来水；模型组：采用高脂饮食致大鼠非酒精性脂肪性肝：高脂饮食配方：普通饲料84％、猪油14％、胆固醇2％；分别在第8、10周末每组各取6只隔夜禁食处死大鼠采集标本，留取肝组织待检,12周取18只隔夜禁食处死大鼠采集标本，留取肝组织待检(预试验表明TGF-β1在8,10周肝组织中表达不明显)。

1.2.2肝脏组织HE染色及脂肪肝判断标准：取部分肝右叶放于10％中性福尔马林液中固定，石蜡包埋，5μm切片，并HE染色后在显微镜下观察。

1.3标本处理所有标本连续切片5张，厚为4μm，置于经多聚赖氨酸（Poly-L-Lysin）处理过的玻片上，58℃烤片2h后4℃保存。再各取石蜡标本10μm3张，置于1.0ml无菌Eppendorf管中，4℃保存备用。

1.4TGF-β1的免疫组化检测采用免疫组织化学方法,将组织切片与兔抗鼠TGF-β1抗体共孵化,4℃过夜,生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)处理后,滴加SABC,DAB显色,苏木素轻度复染,脱水、透明、封片。TGF-β1表达免疫组化阳性信号为棕黄色,结果判断标准:在放大400倍下,每张切片随机选取10个视野,通过灰度计算阳性面积以及阳性面积占总面积的百分比（即阳性率）。

1.5结果判断细胞浆内含有棕黄色颗粒者为TGF-β1阳性表达。在放大400倍下,每张切片随机选取10个视野,通过灰度计算阳性面积以及阳性面积占总面积的百分比（即阳性率）。

1.6统计方法采用SPSS13.0系统软件包，计量资料结果以±S表示，采用t检验和单因素方差分析；计数资料采用χ2检验。以P<0.05为显著性差异指标。对所采集数据用Excell2003软件手工辅助进行制图。

2结果

两组模型的阳性表达

2.1非酒精性脂肪肝模型大鼠(12周)的TGF-β1的阳性表达高于正常模型大鼠的TGF-β1的阳性表达，两组比较有统计学意义(P=0.0052,P<0.01)。

2.2TGF-β1在非酒精性脂肪肝模型大鼠肝脏组织中的表达TGF-β1阳性染色主要定位于细胞浆，呈棕黄色颗粒，灶状、巢状或散状分布。

表1大鼠肝组织中(12周模型大鼠)TGF-β1的阳性表达对照(n=18,（S）

3讨论

3.1非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指临床病理上从仅出现单纯性脂肪肝到发生非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis,NASH)和进一步演变为肝纤维化、肝硬化的一种疾病。范建高等用普通饲料加2％胆固醇、10％猪油给大鼠食用24周后，其体重、肝指数显著高于正常对照组，8周进展为单纯性脂肪肝，12－24周表现为脂肪性肝炎，即在单纯性脂肪肝的基础上出现小叶内和汇管区的炎症，程度进行性加重，24周所有造模大鼠均出现窦周纤维化。本课题主要对非酒精性单纯性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎两个阶段进行研究。

3.2TGF-β1与非酒精性脂肪肝的关系TGF-β1是一类分布广泛的超基因家族细胞因子，到目前为止已发现了60个成员。目前研究得最多的是TGF-β1，被认为在肝脏纤维化的形成中扮演了重要的角色,在众多与肝纤维化有关的细胞因子网络中起中心作用[10]。

TGF-β1在NAFLD的发生发展中的作用：目前研究认为TGF-β1能够促进肝星状细胞（HSC）的活化、增加细胞外基质的合成与沉积并抑制其降解，而HSC活化增殖是肝纤维化发生发展的中心环节。TGFβ1还可对基质降解、细胞凋殖分化、细胞调亡以及免疫功能进行调节，具有多种生物学效应。正常肝细胞中的HSC仅分泌少量的TGF-β1，一旦受到刺激纤维生成的因素时，其作为应答细胞便大量分泌TGF-β1，而TGF-β1又可以促进HSC转化成MFB,且在这个过程中起中枢作用[14]。近年研究表明，在HSC的转化过程中，表型的变化和诱导基质合成是两个独立的过程。后者是由Smad和MAPK依赖的TGF-β1信号通路介导的。

TGF-β1在肝纤维化发生，发展过程中具备活化HSC，促进胶原基因表达，促进ECM合成，抑制ECM降解，促进成纤维细胞趋化和上皮-间质细胞转化为脂肪细胞等多种作用。在本实验中TGF-β1在12周肝组织中的表达明显高于8周、10周肝组织中的表达，同时肝组织切片染色提示12周肝组织的脂肪化，纤维化程度远远高于8周、10周。TGF-β1在非酒精性脂肪肝病大鼠模型肝脏组织中的表达高于正常组,提示非酒精性脂肪肝病的发生与TGF-β1的异常表达有关。

参考文献

[1]钟岚，范建高.非酒精性脂肪肝动物模型.国外医学消化系统疾病分册，1999，19（3）175－178.

[2]孙大裕.脂肪肝动物模的研究进展.中华消化杂志2002，22（5）：305－306.

[3]钟岚，范建高，王国良，等，肥胖、高脂血症性脂肪性肝炎模型的建立.实验动物科学与管理.2000，17(2)：16-20.

[4]陈世清,刘杞,等.脂肪肝胰岛素抵抗大鼠模型的建立.中华肝脏病杂志.2005,13(2):105-108.

[5]MarchesiniG,BriziM,BianchiG,etal.Nonalcoholicfattyliverdisease:afeatureofthemetabolicSyndrome[J].Diabetes,2001,50:1844-1850.

[6]范建高,徐正婕,王国良,等.大鼠非酒精性脂肪性肝炎形成过程中血清内毒素含量的变化.中华肝脏病杂志.2003,2(11):73-76.