罗小玉许云飞梁萍范振华王笑天(和田地区疾病预防控制中心848000)
【中图分类号】R446【文献标识码】B【文章编号】1672-5085(2009)18-0104-02
【摘要】在微生物实验室中,菌种的保存是一项不可缺少的重要工作。在日常工作中从样品中分离出的有价值菌株需要进行分析研究,诊断用品的制备,菌苗的生产,药物的抑菌试验等都需要保存一套比较完整的菌种。现在常用的菌种保存方法有培养基保存法、真空冷冻干燥法等,不论哪种方法均以保存时间长、菌种不变异,操作简便为最佳标准。由于工作的需要于2000年8月-2005年2月,经多次试验摸索出以棉棒为载体的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等棉棒菌种保存法,同时与冷冻真空干燥法进行了比较,通过不同保存时间对细菌存活率菌落形态、染色、生物反应的观察比较,证实棉棒保存法与真空冷冻干燥法结果相同令人满意,该方法简便,且易于掌握,适用于基层疾病预防控制中心的菌种保存工作,有实际推广应用价值。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株大肠杆菌(NIPBP44113)金黄色葡萄球菌(NIPBP26112)绿脓杆菌(NIPBP10211)、均由生物制品研究所提供菌种。
1.1.2培养基营养琼脂、吐温80琼脂、营养肉汤、Baird-ParKer琼脂、乙酰胺琼脂绿脓菌素培养基、明胶培养基、伊红美兰平板、上述均为干燥培养基,由杭州天和微生物试剂有限责任公司生产。干燥兔血浆。
1.1.3棉棒、菌种管。
(1)用普通棉棒,置于干燥箱160℃灭菌2小时备用。
(2)普通营养肉汤,每管10mL经高压灭菌。(121℃20min灭菌备用)
1.2.方法
1.2.1棉棒吸附法
(1)将灭菌棉棒浸泡在接种标准菌株的肉汤中,置37℃培养18-24小时,经培养的肉汤棉棒管呈混浊状。
(2)用灭菌钳子将棉棒取出,放入灭菌管中,置冰箱冷藏室保存。(-10℃-20℃)
(3)将冷藏保存12个月、18个月、36个月的带菌棉棒取出,放入肉汤中置37℃培养18-24小时进行增菌。
(4)观察经培养18-24小时进行增菌,不同菌株的增菌物分别接种在不同的选择平板上,观察生长及菌落形态,再进行革兰氏染色,金黄色葡萄球菌进行甘露醇发酵、血浆凝固酶试验,铜绿假单胞菌进行氧化酶、绿脓菌素、明胶液化等试验,大肠杆菌做乳糖发酵试验。通过上述生化试验观察保存效果。
2结果
2.1存活观察三种细菌通过保存12个月、18个月、36个月仍存活而且未用复苏修补培养,生长良好。
2.2形态染色两种方法三种细菌经分离培养金黄色葡萄球菌在Baird-ParKer培养基上仍为黑色周围有沉淀环菌落。绿脓假单胞菌在乙酰胺平板仍为边缘不整,菌落周围培养基略带粉红色。大肠杆菌在伊红美兰平板光滑湿润有明显的金属光泽。两种方法保存菌落形态没有任何变化,经过革兰氏染色,菌体也未发现有何改变。
3讨论
3.1一般保存菌种方法有10多种,保存菌类方法不同,基本保存也不同。一般实验室常用的有培养基保存方法,根据保存不同微生物进行选择不同培养基,如普通营养琼脂制成半固体斜面,血高层、厌氧菌用疱肉培养基等定期移植,一般保存3-6个月需要传代一次。操作简便,其缺点是容易引起细菌变异,而且转种不及时经常会引起细菌死亡。冷冻真空干燥保存菌种一般认为保存时间长,可在2年以上,且不易变异是理想方法的保存方法,但该法需要冷冻真空干燥设备,一般实验室不具备条件,而且还需要对菌种适当的保护等,在进行的一系列操作过程中,稍不注意容易造成污染,该法适用于科研单位或有条件的实验室用。
3.2我们摸索的棉棒吸附法,通过试验证明至少可保存三年以上,仍能存活且不变异,该法最大优点是在一般实验室条件下就能使用,不受条件的限制。至于保存菌种的种类,我们选择了与卫生细菌检验有关的三个菌种,其属于肠杆菌属,假单胞菌属,和微球菌属,是否与上述三类菌抵抗力相似的有关细菌,能否参考使用该法保存,可延长时间扩大细菌的种类还需进一步探索。
参考文献
[1]江西省卫生防疫站.何晓青主编卫生防疫检验(细菌检验),1980年.
[2]北京市卫生防疫站编.卫生防疫微生物检验规程,上册(内部资料),1990年.