钙激活性中电导钾离子通道与整合素β1在人宫颈癌发病中的作用研究

钙激活性中电导钾离子通道与整合素β1在人宫颈癌发病中的作用研究

刘成红李琼

刘成红李琼（通讯作者）（重庆市重庆现代女子医院400050）

【中图分类号】R737.33【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2010）10-027-04

【摘要】目的通过对人宫颈癌Hela细胞、宫颈上皮内瘤样病变（CIN）组织及人正常宫颈上皮组织中钙激活性中电导钾离子通道（IKCa1）蛋白含量及整合素β1蛋白产物的测定，探讨三种组织中IKCa1蛋白和整合素β1存在的差异及其与人类宫颈癌发生、发展存在的关联。方法（1）复苏及培养人宫颈癌Hela细胞株，同时随机采集临床手术治疗的数十例宫颈CIN组织及正常宫颈上皮组织，在三组标本中加入细胞裂解液，采用低温离心法提取全蛋白质。（2）将提取的全蛋白质应用酶联免疫(ELISA)技术分别研究14例正常宫颈上皮组织、14例宫颈上皮内瘤样病变（CIN）组织及14份宫颈癌Hela细胞中IKCa1蛋白和整合素β1的表达差异，初步了解IKCa1蛋白和整合素β1在三种组织细胞中表达差异的趋势。结果（1）宫颈癌Hela细胞中IKCa1蛋白的浓度范围(ng/dl)为25.1821±1.82523，明显高于CIN组织的12.6614±1.08134及正常宫颈上皮组织的9.6486±1.35034，两两比较P均<0.05，其结果差异均存在统计学意义（F=450.65,P<0.0001）。（2）在14例正常宫颈上皮组织中、14例宫颈癌前病变（CIN）组织中、14瓶培养的传代宫颈癌Hela细胞中整合素β1蛋白表达的浓度范围(ng/dl)分别为:29.4414±1.50857、24.9107±1.54259、18.2486±1.083482，其两两比较结果存在差异，且差异具有统计学意义（F=165.94,P<0.0001）。结论宫颈癌细胞中IKCa1蛋白的表达明显高于CIN组织和正常宫颈上皮组织，而整合素β1的表达明显低于CIN组织和正常宫颈上皮组织。IKCa1蛋白的表达水平在宫颈癌、宫颈上皮内瘤样病变、正常宫颈三者间呈递减趋势；而整合素β1的表达水平在宫颈癌、宫颈上皮内瘤样病变、正常宫颈三者间呈递增趋势。IKCa1和整合素β1的异常表达与宫颈癌的发生发展密切相关，减低或增加它们表达可能减少及减慢宫颈癌的进展。

【关键词】宫颈癌钙激活性中电导钾离子通道整合素β1CINELISA

子宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌，据报道，全世界每年大约有50万新发宫颈癌病例，占妇女新发癌症病例数的15%。经过多学科长期的联合努力，宫颈癌的发病率和死亡率虽已大幅下降，但是近年流行病学统计却发现，宫颈癌的发病率又有了增高的趋势，并且发病年轻化十分明显且其病理类型已有明显改变，这一系列变化使得对宫颈癌的诊断和治疗难度加大，尤其在发展中国家更为明显，有研究发现，发展中国家宫颈癌的发病率是发达国家的6倍，并且其中80%的患者确诊时已是浸润癌[1-2]。因此为了更好的提高宫颈癌的诊断准确率、改进对其的预防及治疗手段，针对宫颈癌的发病机理等基础方面的研究课题也就日益引起关注。近年来随着干细胞研究的不断深入,越来越多的证据说明肿瘤可能起源于正常干细胞的转化,起源于一些未分化或微分化的干细胞,这是由于组织更新时所产生的分化异常所致。研究表明:整合素的表达的异常及其信号转导通路的异常与肿瘤的发生发展及分化异常关系密切,整合素表达量的异常,可使干细胞不能按正常途径进行分化增殖,从而导致上皮细胞病变乃至癌变[3，4]。同时研究还发现，包括钾离子通道在内的离子通道在肿瘤细胞的增殖中发挥了重要的作用,而IKCa1与恶性肿瘤关系的研究也取得了较为明显的成果,IKCa1的基因活化、表达增强、通道开放率和电压强度增加、通道密度增加等都伴随着肿瘤细胞的明显增殖，从而证明了IKCa1与恶性肿瘤的发生发展密切相关[5-7]。本研究应用酶联免疫(ELISA)技术寻找宫颈癌细胞与宫颈癌前病变组织及正常宫颈上皮组织中钙激活性中电导钾离子通道(intermediateconductance-Ca2+-activatedK+channels,IKCa1)和整合素β1（β1integrin）的表达差异趋势，从分子水平上初步探讨IKCa1和β1integrin在宫颈癌发生和发展中所起作用以及两者间的相互关系。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1组织标本

正常宫颈上皮组织来源于2008年6月至2008年12月在泸州医学院附属医院妇科行子宫全切除术的正常宫颈组织标本共15例，术前及术后病理学证实宫颈无恶性病变存在，术后立即取宫颈鳞柱交接部组织；宫颈CIN组织来源于同期经宫颈活组织病理学确诊并行LEEP刀治疗及宫颈锥切或子宫切除手术治疗的患者，共20例，手术切除后立即取病灶处组织。

1.1.2细胞标本

以宫颈癌Hela细胞株作为研究对象，购自重庆医科大学，Hela细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM／F12培养基中。

1.2方法

1.2.1细胞标本的获取和处理

Hela细胞的复苏和培养：细胞复苏成功后传代（1传3），传至第5至8代作为细胞标本，同时冻存部分细胞备用。

1.2.2组织标本的获取和处理

分别在无菌操作下取正常宫颈鳞柱交接部位组织及宫颈CIN病变组织体积约1.0×1.0×0.5cm3置于无菌冻存管内，再置于液氮罐中保存。

1.2.3总蛋白的提取

按照蛋白提取试剂盒说明书操作，先对三组标本进行细胞消化，再分别提取各标本总蛋白至DEPC预处理的EP管中，分别标记好后置于-70℃超低温冰箱中保存待用。

1.2.4ELISA技术检测IKCal蛋白和β1integrin的各自表达趋势

按照ELISA试剂盒（IKCal的ELISA试剂购于美国ADL公司）说明书进行。首先取出酶标板,依照次序对应加入50ul的标准品于空白微孔中，同时分别标记样品编号（冻存的Hela细胞总蛋白、宫颈CIN组织蛋白及正常宫颈上皮组织蛋白各取14管分别编号）,每管各取50ul样品（蛋白）加入空白微孔中；再分别在每个样品孔中加入10ul的生物素标记液，之后再在标准品和样品孔中均各加入100ul的酶标记液。将酶标板于37℃孵育反应60分钟后洗板5次（每次洗板后静置10～20秒钟），再在标准品和样品孔中均依次加入底物A、B液各50ul，再于37℃避光孵育反应15分钟后每孔加入50ul终止液。将酶标板放入事先已设定好的酶标仪(美国BIO-RAD公司)内,用SkanItSoftware2.2.1（Bio-Rad公司）软件定量分析，绘制标准曲线和根据样品的OD值找出对应浓度范围(ng/dl)，以此表示IKCal蛋白的相对浓度。以同样方法测定β1integrin（β1integrin的ELISA试剂也购于美国ADL公司）的相对浓度。

1.3统计学方法

采用SPSS11.5软件进行统计学分析。IKCal蛋白、β1integrin的相对浓度的比较采用方差分析独立样本的非参数检验。

2结果

2.1酶联免疫法(ELISA)测定的细胞组织中IKCal蛋白浓度

宫颈癌Hela细胞总蛋白、宫颈CIN组织蛋白及正常宫颈上皮组织蛋白各14例经酶联免疫反应后42例样品均为阳性，阳性率100％。因ELISA法存在假阳性的误差，故阳性率的比较无统计学意义。但IKCal蛋白浓度在宫颈癌Hela细胞、宫颈CIN组织、正常宫颈上皮组织中存在差异，三者间呈明显递减趋势，两两比较差异均有统计学意义(P<0.0001)。见表1。

2.2细胞组织中整合素β1蛋白的浓度

整合素β1蛋白的浓度在宫颈癌Hela细胞、宫颈CIN组织、正常宫颈上皮组织中存在差异，三者间呈明显递增趋势，两两比较差异均有统计学意义(P<0.0001)。见图1及表2。

Fig.1StandardCurve

3讨论

子宫颈癌是全球妇女中仅次于乳腺癌的第二大恶性肿瘤，具有恶性肿瘤的共性，由于细胞分化不成熟从而具有生长迅速、浸润破坏组织器官、远处转移、对机体影响严重等生理行为，其发生发展亦是一个多因素相互作用的连续、复杂的过程。正常宫颈上皮在原始鳞-柱交接部和生理性鳞-柱交接部间形成移行带区，移行带区未成熟的化生鳞状上皮代谢活跃，在一些物质（如阴道毛滴虫、单纯疱疹病毒以及人乳头瘤病毒等）的刺激下，可发生细胞分化不良，排列紊乱，细胞核异常，有丝分裂增加，形成宫颈上皮内瘤样病变（CIN）。宫颈上皮化生过度活跃，伴某些外来致癌物质刺激，或宫颈上皮内瘤样病变（CIN）继续发展，异型细胞突破上皮下基底膜，累及间质，则形成宫颈浸润癌。宫颈癌由于细胞分化不成熟而使其生长迅速，并能浸润破坏组织器官和发生远处转移、复发，对机体造成严重危害。大量研究发现，这一过程涉及到细胞离子通道的改变以及包括β1整合素在内的细胞粘附分子在肿瘤细胞的增殖及肿瘤的侵袭转移过程中具有重要的作用。

3.1IKCal在人宫颈癌中的表达研究

近年的研究发现，IKCa1在恶性肿瘤组织和来源于肿瘤的细胞系中呈现异常的高表达，通过多种途径造成大量的Ca2+的内流，内流的Ca2+引起细胞有丝分裂的异常，导致细胞增殖活跃，促使肿瘤的发生。IKCa1在乳腺癌、前列腺癌及胰腺癌等恶性肿瘤组织中呈高表达，而在正常组织或细胞中却不表达或弱表达[8、9-10]。IKCa1与恶性肿瘤关系的研究取得了较为明显的成果,大量的技术手段广泛运用于其中,这些研究从不同角度表明了IKCa1的基因活化、表达增强、通道开放率和电压强度增加、通道密度增加等可能会导致细胞的增殖和凋亡的失调以及细胞迁移能力的改变，伴随着肿瘤细胞的明显增殖[11]。

本实验着手寻找宫颈癌细胞与宫颈癌前病变组织及正常宫颈上皮组织三者间IKCa1蛋白质的表达差异趋势，通过对IKCa1表达情况的研究从分子水平上初步探讨IKCa1在宫颈正常上皮向宫颈癌的转化过程中以及宫颈癌的转移复发过程中可能起的作用。钙激活性钾离子通道是钾离子通道大家族中的一个重要组成部分，因其具有调节膜电位和细胞内钙离子浓度的功能，故此类钾离子通道是细胞活动的重要调节者。本研究结果显示，宫颈癌Hela细胞中IKCal蛋白的阳性表达率、表达水平均高于宫颈癌前病变CIN组织和正常宫颈上皮组织中IKCa1蛋白的阳性表达率、表达水平；而且宫颈癌前病变CIN组织和正常宫颈上皮组织相比较，其IKCal蛋白的阳性表达率、表达水平均明显高于正常宫颈上皮组织，三者间呈明显递减趋势。本研究结果提示，在宫颈癌中，宫颈上皮细胞从正常的细胞至转化为肿瘤细胞期间常伴随一系列的基因改变，这个过程可能影响细胞钾离子通道表达的改变或导致钾离子通道活性的改变，大量存在于宫颈癌细胞及癌前病变组织内的IKCa1蛋白可能通过破坏细胞内外Ca2+平衡，激活控制细胞周期的信号传导通路而促进癌细胞的异常增殖；同时还可能激活某些原癌基因，造成细胞的异常增殖。IKCal在宫颈癌细胞和宫颈癌前病变CIN组织中的高表达，显示该离子通道可能参与了宫颈癌的发生、发展过程。由此可见，IKCa1在人类宫颈鳞状上皮细胞癌的发生和发展中起着重要作用，过度表达的IKCa1造成宫颈上皮细胞有丝分裂过程的失控，可能是宫颈鳞状上皮细胞癌发生的机制之一。

3.2宫颈癌中整合素β1(β1integrin)蛋白产物的表达

整合素是由一个α亚单位和β亚单位通过非共价键连接而成的异二聚体跨膜粘蛋白,其中β1整合素是介导细胞外基质信号的最主要的细胞表面受体,对维持组织结构的完整性具有重要意义[12]。众多研究发现:整合素β1表达缺失与乳腺、膀胱、肾上腺等肿瘤的发生及侵袭和转移密切相关,恶性肿瘤组织中β1integrin的表达明显低于正常组织[13-14]。近年来对于整合素β1在妇科领域的研究越来越多,尤其是在宫颈癌方面的研究。但是在宫颈癌的癌变过程中,从宫颈正常上皮-宫颈上皮不典型增生-宫颈鳞癌这一发展过程中,是如何影响β1整合素的表达量的变化的,同样β1整合素表达量在宫颈癌变过程中又是如何改变的,目前此方面的报道甚少。

本研究主要从整合素β1蛋白表达产物在正常宫颈上皮、宫颈不典型增生上皮及宫颈癌细胞中的表达着手,从分子水平上进一步探讨整合素β1在宫颈癌发生发展中所起的作用。本实验应用一种可靠的少量蛋白的诊断验证法——蛋白印迹(Westernblot)检测整合素β1蛋白在组织及细胞株中的表达情况发现:宫颈癌Hela细胞中整合素β1蛋白的阳性表达率、表达水平均低于宫颈癌前病变CIN组织和正常宫颈上皮组织中整合素β1蛋白的阳性表达率、表达水平；而且宫颈癌前病变CIN组织和正常宫颈上皮组织相比较，其整合素β1蛋白的阳性表达率、表达水平均明显低于正常宫颈上皮组织，三者间呈明显递增趋势,结果同目前相关报道一致[15]。结果提示,整合素β1蛋白的低表达或缺失表达与正常宫颈上皮→宫颈上皮内瘤变(CIN)→宫颈癌的过程关系密切。可能与其削弱了干细胞与基底膜的相互作用及异常的细胞信号传导通路，使细胞逃避了正常的分化调控有关。这可能说明正常宫颈上皮组织中整合素β1蛋白的表达下降通过使机体对细胞生长、分化的生物学过程的控制作用减弱，导致正常宫颈上皮细胞分化不良，分化不良的细胞从基底膜上脱落，进入增殖周期，形成宫颈上皮内瘤变（CIN）；整合素β1蛋白表达的进一步降低或者表达的缺失使机体对瘤变细胞生长、分化的生物学过程的控制作用进一步减弱，瘤变的细胞分化明显不良，进而导致肿瘤的形成。

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