锡类散微生物限度方法学验证

锡类散微生物限度方法学验证

王巍钱丹华

王巍钱丹华（滁州市食品药品检验所安徽滁州239000）

【中图分类号】R37【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2011)14-0079-03

【摘要】目的建立锡类散微生物限度检验方法。方法按2010年版中国药典[1],用大肠埃希菌，枯草芽胞杆菌，金葡菌，黑曲霉和白色念珠菌对锡类散进行微生物限度检验方法学验证实验。结果采用常规法，5种阳性菌的回收率均小于70%；采用稀释法，回收率均大于80%。控制菌检查试验组采用稀释法,检出了控制菌菌。结论用稀释法能有效的去除锡类散中的抑菌活性。用该法进行微生物限度检查,可行性强,能达到检测目的。

【关键词】锡类散微生物限度检查方法稀释法控制菌检查回收率

【Abstract】Objective:Toestablishamethodformicrobiallimitexaminationofxileipowders.Methods:FollowingthemethodformicrobiallimitexaminationinChinesePharmacopoeia2005thedition,themicrobialexaminationofxileipowderswerevalidatedusingEscherichiacoli,Bacillussubtilis,Staphylococcusaureus,AspergillusnigerandCandidaalbicans.Results:Bycommonlymethod,therationofalltestmicrobialgroupwerebelow70;Itwasalsofoundbyculturemediumdilutingmethodthatalltheratioswere>80%.Escherichiacoliwasdetectedincontrolbacteriaexaminationbyculturemediumdilutingmethod.Conclusion:Themethodofculturemediumdilutingcaneffectioneliminationthebacteriostasisactivenessofxileipowders.Themethodusedtolimitmicrobialexamination,feasibilitystrong,andcanachievedetetionpurpose.

【Keywords】xileipowdersthemethodofculturemediumdilutingfiltrationmembranerecovery

锡类散是一种由牛黄、珠粉等组成的药物，主治咽喉腐烂，唇舌肿痛等口腔疾患。根据药典要求,本品需接受微生物限度检查方法学验证。然而在常规检验中,许多中药及天然药物提取物本身具有抑菌活性,从而影响了其污染微生物的检出,导致药品的细菌、霉菌、酵母菌及控制菌的检出率降低，[2]会影响试验结果的可靠性,所以对有抑菌作用的中成药做微生物限度检查时,必须采用适当的方法,对含抑菌成分的供试品消除抑菌活性后,微生物限度检查结果才能反映出药品的真实污染情况。

1培养基

胆盐乳糖培养基、玫瑰红钠培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基(均由北京三药科技开发公司提供)。

2验证试验用菌种

(1)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]；(2)枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC(B)63501]；(3)大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]；（4）白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]；(5)黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]。(6)铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa）[CMCC(B)10104]。

3仪器

恒温恒湿培养箱编号：SC-018霉菌培养箱编号：SC-017

4验证方法

4.1菌液制备

4.1.1取经37℃培养24小时，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、铜绿假单胞菌肉汤培养物1ml，加至9ml盐水中10倍稀释至10-4～10-7为50～100个/ml，做活菌计数备用[3]。

4.1.2取经25℃培养48小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml，加至9ml盐水中10倍稀释至10-5～10-7为50～100个/ml，做活菌计数备用。取经25℃培养一周的黑曲霉斜面培养物，加入3～5ml灭菌0.9%氯化钠溶液，轻轻振摇，洗下霉菌孢子，吸出菌液用标准比浊管比浊，稀释至每ml含50～100CFU菌液备用。

4.2供试液制备[4]:称取样品10g，加PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液100ml，浓度为1：10供试液。

5检验方法

5.1平皿法：取1:10供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，再取1ml上述5种试验菌株，加入平皿中，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌加营养琼脂培养基20ml，白色念珠菌和黑曲霉菌加玫瑰红钠琼脂20ml混匀，待凝固后，置规定温度培养24～72小时观察结果，细菌计数，测定回收率。

5.2培养基稀释法：取1:10供试液0.5ml、0.2ml，分别置直径90mm的无菌平皿中，再取1ml上述5种试验菌株，加入平皿中，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌加营养琼脂培养基20ml，白色念珠菌和黑曲霉菌加玫瑰红钠琼脂20ml混匀，待凝固后，置规定温度培养24～72小时观察结果［56］，细菌计数，测定回收率。

6回收率测定

6.1平皿法

6.1.1试验组：取供试品的1：10供试液1ml和上述5种试验菌株各1ml，加入平皿中，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌加营养琼脂培养基20ml［7］，白色念珠菌和黑曲霉菌加玫瑰红钠琼脂20ml混匀，待凝固后，置规定温度培养48～72小时观察结果。

6.1.2菌液组

测定每一菌株加的试验菌数

6.1.3供试液对照组

除不加菌液外，同试验组测定方法。

细菌、霉菌（酵母菌）检查

细菌总数（36℃48h）霉菌（酵母菌）总数（25℃72h）

测定供试品本底菌数

6.2培养基稀释法

6.2.1试验组：取1:10供试液0.5ml、0.2ml，分别置直径90mm的无菌平皿中，再取1ml上述5种试验菌株，加入平皿中，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌加营养琼脂培养基20ml，白色念珠菌和黑曲霉菌加玫瑰红钠琼脂20ml混匀，待凝固后，置规定温度培养48～72小时观察结果［8］。

6.2.2菌液组

测定每一菌株加的试验菌数

6.2.3供试液对照组

除不加菌液外，同试验组测定方法。

细菌、霉菌（酵母菌）检查

细菌总数（36℃48h）霉菌（酵母菌）总数（25℃72h）

测定供试品本底菌数

7结果判定

表1细菌数计数

表3试验组细菌数计数(平皿法)

表4试验组细菌数计数(培养基稀释法)

表5回收率

由表5可见，使用平皿法,5株阳性代表菌株回收率均为70%以下。使用培养基稀释法（0.5/皿、0.2ml/皿），5株阳性代表菌株回收率均为70%以上。实验结果表明，锡类散的微生物限度检查，细菌、霉菌及酵母菌检查用培养基稀释法（0.5ml/皿）［9］。

8控制菌检查

8.1铜绿假单胞菌（培养基稀释法）

8.1.1阳性对照菌的制备：取铜绿假单胞菌接种营养琼脂斜面上.在35℃培养18-24小时,用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含10-100个菌悬液备用.

8.1.2实验方法

8.1.2.1阳性对照组：取铜绿假单胞菌的菌悬液1ml,加入1瓶200ml无菌胆盐乳糖增菌培养液中,在35℃培养18-24小时,观察.

8.1.2.2供试品组与试验组：取制备后1:10供试液,分别加入2瓶200ml无菌胆盐乳糖增菌培养液中,各10ml,其中试验组加入铜绿假单胞菌的菌悬液1ml,在35℃培养18-24小时,观察.

8.1.2.3阴性对照组：取1瓶200ml无菌胆盐乳糖增菌培养液,加稀释液10ml,在35℃培养18-24小时,观察.

8.1.2.4取上述培养物2环,划线接种于溴代十六烷基三甲胺琼脂培养基的平板上,35℃培养18-24小时。

8.1.2.5结果观察铜绿假单胞菌检查阴性对照组中无菌生长。

BL培养基批号：090318溴代十六烷基三甲胺琼脂培养基批号：100128

注：表中“+”表示试验结果检出控制菌；表中“—”表示试验结果未检出控制菌。

8.1.2.6根据上述实验结果，本控制菌检查采用培养基稀释法。

9讨论

按照中国药典2010年版微生物限度检查法中常规法检验，采用常规法测定时，加入几种实验菌的回收率远远小于70%，说明该药品中有抑菌成分，对方法学验证带来不便。故对制备好的供试液用稀释剂稀释后再进行计数方法的验证,其菌回收率均达到80%以上。通过对本品的微生物限度检查计数方法的验证及控制菌检查方法的验证，在处方，生产工艺及检测环境不变的情况下，采用稀释法可以进行本品的微生物限度和控制菌检查。

参考文献

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[M]．北京：中国医药科技出版社，2010.01.

[2]马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册[M].北京:科学出版社.2001:51.

[3]张玉兰,林宣伟.几种微生物检查法阳性对照菌液存活时间的探讨[J]．中药材,2003,26(12):883.

[4]郑钧镛，王光宝.药品微生物学及检验技术[M].北京:人民卫生出版社,1989.

[5]马绪荣,苏德模.药品微生物学检验手册[M].科学出版社.

[6]郑均镛,王光宝.药品微生物学及检验技术[M].北京：人民卫生出版社,1989,143.

[7]付春华.卫生学检查中培养基的灵敏度[J].中成药,1995,17(10):14.

[8]李佳宁.影响微生物限度检查方法验证结果的若干因素分析[J].中国药业，2007，16（9）：35—36.

[9]黄英.药品微生物限度检验误差分析[J].中国药师,8(2):173.