人IIA型PLA2衍生肽分子CT17杀菌活性研究

人IIA型PLA2衍生肽分子CT17杀菌活性研究

淳于柳爽梁宁生(通讯作者)

淳于柳爽梁宁生(通讯作者)

（广西医科大学附属肿瘤医院药学部广西南宁530021）

【摘要】目的研究和比较人ⅡA型磷脂酶A2(phospholipaseA2，PLA2)衍生多肽CT17对不同细菌在体外的杀菌效应。方法根据人ⅡA型PLA2氨基酸顺序分别设计合成肽分子CT17（p51-67）。采用琼脂铺板计数法测定杀菌活性，将不同浓度衍生肽分别与革兰氏阳性菌（G+）金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、屎肠球菌和革兰氏阴性菌(G-)大肠杆菌、绿脓杆菌、鲍曼不动杆菌在37℃孵育2.5h，然后铺板并置于37℃恒温箱培养18～24h，记录每一琼脂板上的菌落数(CFU)，并计算多肽作用后的杀菌率。结果IIA型PLA2CT17对G+菌与G-菌均有较强的杀菌活性。结论衍生自人ⅡA型PLA2保守区域17个氨基酸残基的肽M17对G+菌和G-均有较强的杀菌活性，这可能与M17肽分子更易于与细菌结合并发挥作用有关。

【关键词】人ⅡA型磷脂酶A2保守区域抗菌肽衍生肽

【中图分类号】R96【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）17-0128-02

【Abstract】ObjectTostudyandcomparethebactericidalactivityofthepolypeptideCT17whichderivesfromhumanGroupⅡAphospholipaseA2(PLA2,phospholipaseA2)invitro.MethodsPeptideCT17(p51-67)wassynthesizedaccordingtothesequenceofhumanGroupⅡAPLA2aminoacid.Sixspeciesofbacterial,Grampositive(G+)Staphy1ococcusaureus,Bacillussubtilis,Enterococcusfaecium,Gramnegative(G-)Escherichiacoli,Acinetobacterbaumannii,Bacilluspyocyaneus,wereincubatedwithdifferentconcentrationofpolypeptidesat37℃for2.5hoursinawaterbathrespectively.Thenthereactionsolutionwasdilutedandagarplateswerepoured.After18-24hoursincubationinthethermostatedcontainerat37℃.Thecolonyformedunitswerecountedandthebactericida1rateswerecalculated.ResultsPLA2CT17possessedpotentbactericidalactivityontheG+bacteriaandG-bacteria.Conclusions:PeptideCT17derivedfromhumanⅡtypeAPLA2highlyconserveregionpossessesastrongbactericidalactivity,thismayberelatedtotheCT7peptidemoleculesmoreeasilybindingtobacteria.

【KeyWord】HumanGroupIIAphospholipaseA2ConservedregionAntibacterialpeptidDerivedpeptide

临床上日益严重的的细菌耐药问题已经引起社会的广泛关注，无论在国内还是国外，都在积极的面对这一问题。普遍认为，通过合理使用抗菌药物可以延缓和控制耐药菌的产生，而对于耐药菌，则要依赖不断开发新型抗菌药[1]。开发新型抗菌药的方式有多种，其中抗菌肽是研究热点之一。自然界中的动物，昆虫甚至微生物都天然存在有抗菌肽，它们的分子大小可以从几个氨基酸残基到几十个氨基酸残基，由于这些抗菌肽有着与目前临床上使用的抗菌药物完全不同的杀菌机制，故被认为有可能成为成为替代常规抗菌药物用于对付耐药菌的新型抗菌药[2]。IIA型磷脂酶A2（phospholipaseA2,PLA2）是一种广泛存在于各种哺乳生物体内的抗菌蛋白，我们曾经以人IIA型PLA2为模版，合成过一些多肽分子，发现其中一些肽分子也具有抗菌作用，这为抗菌肽的开发和应用提供了重要的信息[3,4]。在此篇报道中，我们针对一个新合成的、衍生于IIA型PLA2结构的肽分子CT17进行了抗菌作用的研究，现将结果报道如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂①Hepes和小牛血清白蛋白均为北京Solarbio公司产品。②LB培养基粉(批号：1009533)：生物工程(上海)有限公司提供；③LB营养琼脂(批号：100127)：购自北京路桥技术责任有限公司；④无水CaC12(批号：20081106)：成都科隆化工试剂厂生产；⑤RPMI-1640(批号：970810)为GibcoBRL公司产品。

1.1.2细菌3种革兰氏阳性菌（G+菌）：金黄色葡萄球菌(Staphy1ococcusaureus，ATCC26003)、枯草杆菌(Bacillussubtilis，ATCC63501)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium，ATCC32088)；3种革兰氏阴性菌(G-菌)：大肠杆菌(Escherichiacoli，ATCC44113)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、绿脓杆菌(Bacilluspyocyaneus，ATCC10104)。以上标准菌株均由广西医科大学微生物学教研室提供(购自中国食品药品检定研究院)。

1.1.3主要仪器和设备①AnkeTGL-16C台式离心机：上海安亭科学仪器厂生产；②TU-1810S紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司产品；③Thermo420型恒温气浴摇床：ThermoElectron公司产品；④HWS-20恒温水浴箱：江苏太仓市实验设备厂生产；⑤J3-NAPCO-5410型培养箱：购自克勒格瓦尼(上海)分析仪器有限公司。

1.2多肽的制备：从美国国家生物工程信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)网站获取人IIA型磷脂酶A2蛋白分子的氨基酸顺序，以保守区域第51～67的17个氨基酸残基（YKRLEKRGCGTKFLSYK）为模板，由上海波泰生物工程有限公司将其合成纯度为95%的多肽CT17。多肽使用时，离心收集，溶于高压蒸汽灭菌的双蒸水400μl中，配制成10mg/ml的多肽原液，以20μl/管分装于500μl的Ependorf管中，-20℃冷冻保存。

1.3方法杀菌活性测定采用琼脂铺板计数法，参照文献[5]。①取过夜培养的细菌，按照1:50加入3ml新鲜的LB培养液中，置于37℃恒温气浴摇床中孵育2.5～3h，达到对数生长期。②离心收集，洗涤细菌并将其沉淀物溶于500μl生理盐水中，用紫外分光光度计测得吸光度达0.1OD时所需的细菌量（微升），根据公式计算稀释倍数。③配制细菌孵育体系，吸取多肽和细菌（终浓度为1×109CFU/L）各10μl加入RPMI-1640反应体系（总体积为100μl，10mMHepes,1mMCaCl2、1%BSA，pH值为7.4），混匀后37℃水浴孵育2.5h。④2.5h后，从该体系中取出40μl加入360μl高压灭菌的生理盐水中，连续10倍稀释，共3次。⑤从每次稀释液中取出100μl放置无菌培养皿（60mm）中，加入5ml约55℃高压灭菌LB营养琼脂摇匀，待凝固后，放置于37℃温箱培养。⑥18～24h后取出计算细菌菌落数(colony-formingunits,CFU)，计算不同浓度衍生多肽的杀菌率%：（对照组CFU-实验组CFU）/对照组CFU×100%，并制作杀菌曲线。每组实验重复5次。

1.4统计学分析使用SPSS13.0对所得结果进行统计学分析。

2结果

2.1IIA型PLA2衍生肽CT17的结构

衍生自IIA型PLA2肽分子CT17为碱性分子，且携带净正电荷，其氨基酸的组成中含较多碱性氨基酸，含有极少的酸性氨基酸（CT17肽分子中含有一个酸性氨基酸谷氨酸）。如表1所示

表1IIA型PLA2衍生肽CT17的一级结构

名称结构净碱性氨基酸所占比例净正电荷疏水/亲水性氨基酸比肽链长度

CT17YKRLEKRGCGTKFLSYK29.41%+541.67%17

【说明：蓝色为碱性氨基酸，红色为酸性氨基酸】

2.2衍生肽CT17分子对对G+菌具有较强的杀灭作用

有图1可知，CT17在浓度为200μg/ml时对G+菌具有较强的杀菌活性，杀菌率在78.48%～99.99%之间，杀菌敏感高低依次为：枯草杆菌>金黄色葡萄球菌>屎肠球菌；当浓度增至1mg/ml时，杀菌率在92.75%～99.99%之间，其中枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌率达到99.99%以上。在浓度为200μg/ml时，CT17对枯草杆菌的杀菌活性与对金黄色葡萄球菌、屎肠球菌的杀菌活性有非常显著差异性（P<0.01）。

3讨论

社会对于开发新型抗菌药物有着迫切的要求，这一方面是由于新的耐药菌株不断被发现，且耐药菌的范围在扩大，甚至出现了多重耐药的超级细菌；另外一方面，抗菌药物有着广大的商业市场和经济利益，在我国，抗菌药的销售额一直排在各类药物之首，因此，由于新型抗菌药物的开发有着重要的社会意义和经济意义，故众多学者一直在探索用各种方式开发抗菌药物。抗菌肽的研究已经有较长的历史，它广泛存在于自然界的各种生物中，包括植物，动物，昆虫和微生物等，由于它们与传统抗菌药物有着不同的抗菌机制，被认为是开发新型抗菌药物的良好模板，一些抗菌肽已经进入了临床试验阶段[6]。

人IIA型PLA2是一种广泛存在哺乳生物体内的抗菌蛋白，是生物体内天然免疫系统里的重要组成部分，我们课题组曾对人IIA型PLA2完整分子的抗菌作用和机制做过一系列研究[7]。近年来，我们又根据人IIA型PLA2的分子结构，设计和合成了人IIA型PLA2分子的衍生肽，并对它们的杀菌作用和机制进行了研究和报道[3,4]。在本项研究中，我们根据人IIA型PLA2分子中部的结构，合成了一个17肽分子（P51-67），它具有较强的杀菌活性，而且抗菌谱广，对于常见的革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌，枯草杆菌和屎肠球菌，以及革兰氏阴性菌，如大肠杆菌，绿脓杆菌和鲍曼不动杆菌，都有较强的作用。它对革兰氏阳性菌和阴性菌的杀菌活性是相当的，这与人IIA型PLA2的抗菌谱有很大差别，因为后者对革兰氏阳性菌的作用比革兰氏阴性菌强100倍以上。

目前在自然界发现的抗菌肽几乎都是阳离子多肽，也就是结构中含有较多碱性氨基酸残基而较少或者没有酸性氨基酸残基，另外，它们的分子量都很小，还有结构上的双亲性（既有亲水一面，又有疏水一面），CT17具有以上这些特点。所携带的净正电荷是5，PI为10.02，疏水性氨基酸比例为0.35。Lata等在研究抗菌肽氨基酸组成特点时注意到，具有抗菌活性的肽分子与没有抗菌活性的肽分子相比，具有相对较多的赖氨酸，甘氨酸和异亮氨酸，而CT17也含有相对较多的赖氨酸（4个）和甘氨酸（2个）。CT17分子的这些结构特点是它具有抗菌活性的基础[8]。

C17分子的杀菌机制尚不明确，但考虑到它与多数抗菌肽具有相似的分子结构，故可能也具有相似的作用机制，也就是带有双亲结构的分子，首先是带阳离子（碱性氨基酸）部分与细菌胞膜磷脂的阴离子部分结合，然后胞膜磷脂发生改变，膜变薄，近而形成孔，引起细菌破裂死亡。

我们根据抗菌蛋白人IIA型PLA2分子的一级结构，从124个氨基酸顺序中选取一小段具有抗菌肽特点的顺序，设计和合成了肽分子CT17，并进行了杀菌活性的测定，结果显示，CT17具有较强的杀菌活性，抗菌谱较广，值得进一步的研究。

参考文献

[1]CoatesAR,HallsG,HuY.Novelclassesofantibioticsormoreofthesame?[J].BrJPharmacol.2011,163(1):184-194.

[2]SylviaA.baltzerMHB.AntimicrobialPetides-PromisingAlternativestoConventionalAntibiotics[J].JournalofMolecularMicrobiologyandBiotechnoology.2011(20):228-235.

[3]何睿林，梁宁生.人ⅡA型磷脂酶A2衍生肽P26抗菌作用与结构修饰的研究[J].中国药理学通报.2011(09):1300-1304.

[4]安娜，梁宁生.衍生自人IIA型磷脂酶A2N端的多肽hPLA2N1-11杀菌活性的研究[J].广西医学.2012,34(6):689-691.

[5]WeinrauchYABCLN.Mobilizationofpotentplasmabactericidalactivityduringsystemicbacterialchallenge.RoleofgroupIIAphospholipaseA2[J].JClinInvest.1998,102(3):633-638.

[6]VeldenWJ,VanIerselTM,BlijlevensNM,etc.Safetyandtolerabilityoftheantimicrobialpeptidehumanlactoferrin1-11(hLF1-11).[J].BMCMed.2009,7:44.

[7]梁宁生，李艳，杨帆等.重组人血小板型磷脂酶A2杀菌作用的研究[J].中华医院感染学杂志.2004(10):1-3.

[8]LataS,MishraNK,RaghavaGP.AntiBP2:improvedversionofantibacterialpeptideprediction.[J].BMCBioinformatics.2010,11Suppl1:S19.

基金项目：广西自然科学基金资助项目（NO.2010GXNSFA013246）