2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠模型的建立

2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠模型的建立

李楠徐静

李楠徐静(通讯作者)张春虹王俊红丁石梅张静

(西安交通大学医学院第二附属医院内分泌科710004)

【摘要】目的建立2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠模型。方法雄性SD大鼠24只，随机分为正常对照组（NC组，12只）和2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝模型组（MC组，12只）。正常对照组喂以常规饲料，模型组喂以高脂高糖饲料。12周及14周末测定两组大鼠体重、血糖、血脂、转氨酶、游离脂肪酸、胰岛素等指标。并于12周末给予模型组大鼠腹腔注射链脲佐菌素（30mg/kg）。14周末观察肝脏组织的病理变化。结果12周及14周时模型组大鼠FBG、ALT、AST、tC、TG、LDL-C、VLDL、FFAs、FINs、HOMA-IR均较正常对照组大鼠升高（P<0.05），HDL-C较正常对照组减低（P<0.05）。注射STZ后，模型组大鼠空腹血糖水平均逐渐上升，至第10日达到平稳高值。病理组织学结果表明正常对照组大鼠肝组织结构完整，肝细胞形态规则；模型组大鼠肝组织均可见中至重度脂肪沉积，多数肝小叶结构基本消失，肝细胞索模糊，并伴有高度气球样变，胞质中有大量脂滴空泡，严重者胞质疏松呈渔网状改变，界限不清。结论给予大鼠高脂高糖饲料喂养12周，可出现明显的高脂血症、胰岛素抵抗及脂肪肝，再加注射小剂量链脲佐菌素，即可成功建立2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠模型。

【关键词】2型糖尿病非酒精性脂肪肝大鼠链脲佐菌素

【中图分类号】R965.1【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）02-0115-02

近年来2型糖尿病（T2DM）合并非酒精性脂肪肝（NAFLD）已经成为人类常见多发疾病，发病率逐年上升，随着对其研究的进一步深入，如何建立一个合理的T2DM合并NAFLD模型，成了研究其疾病发病机制、寻找治疗新策略的重要前提条件。本实验通过高脂高糖饮食饲养SD大鼠，再加注射小剂量链脲佐菌素（STZ）诱发高血糖和脂肪肝，为进一步防治T2DMNAFLD的研究提供实验模型。

材料和方法

一、材料

1．实验动物：选用健康雄性SD大鼠共24只，清洁级，体重202g-230g（购于西安交通大学医学院实验动物中心）。每笼6只，饲养于标准环境（温度：23±2℃、湿度：55±5%），每日12小时光照维持昼夜循环，自由进饮食，每天换水、垫料。

2．试剂和仪器：胆固醇、胆酸钠购于上海如吉生物科技发展有限公司；普通饲料购于北京科澳协力饲料有限公司；STZ购于美国Sigma公司，使用前用0.1mmol/LPH为4.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液临时配成1%的溶液；谷丙转氨酶、谷草转氨酶试剂盒购于中生北控生物科技股份有限公司；血脂试剂盒购于南京建成生物工程研究所；游离脂肪酸试剂盒购于英国RANDOX公司；鼠胰岛素试剂盒购于美国R&D公司；7170型全自动生化分析仪（日立公司生产）；680型酶标仪（BIO-RAD公司生产）；CM1900型石蜡切片机（Leica公司生产）；EclipseE100型普通光学显微镜（Nikon公司生产）。

3．高脂高糖饲料：高脂高糖饲料由基础饲料82%，猪油10%，胆固醇2.5%，胆酸钠0.5%，蔗糖5%组成，充分搅拌均匀后，用脱粒机制成大鼠颗粒料，控温烘干。

二、方法

雄性SD大鼠24只，随机分为正常对照组（NC组，12只）和2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝模型组（MC组，12只）。NC组喂以常规饲料，MC组喂以高脂高糖饲料。12周及14周末分别测定各组大鼠体重、空腹血糖（FBG）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、极低密度脂蛋白（VLDL）、游离脂肪酸（FFAs）、空腹胰岛素（FINs），计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。并于12周末隔夜空腹给予MC组大鼠腹腔注射STZ（30mg/kg）[1]一次，NC组注射相应体积的柠檬酸缓冲液。14周末取大鼠肝组织，常温生理盐水冲洗后，经10%甲醛固定，HE染色，光镜下观察肝脏组织的病理变化。

三、统计学处理

所有资料以SPSS16.0统计软件进行分析，检测数据以x-±S表示，计量资料分析采用方差分析和t检验，显著性水准P<0.05。

结果

一、大鼠的一般情况

NC组大鼠毛发光洁、精神状态良好、生长发育正常；MC组大鼠体重增加较NC组快，在注射STZ后2周，MC组大鼠出现毛发易脱落、竖立无光泽，反应迟钝、精神萎靡、生长发育迟缓，并出现了多饮、多尿、多食、消瘦等症状。

二、各项指标比较

1．体重比较：实验开始时，两组大鼠体重无统计学差别；在实验的第4周、8周和12周MC组大鼠的体重均高于同龄正常对照组，在成模后2周MC组大鼠的体重较同龄NC组及MC组12周的体重减低（P<0.05）；见表1。

表1实验中大鼠体重比较（x-±S）

tab1Thecomparisonofratsweight（x-±S）

注：与0周比较，*P<0.05；与同龄NC组比较，△P<0.05。

2．血清学指标比较：12、14周末时，与NC组相比，MC组大鼠FBG、ALT、AST、TC、TG、LDL-C、VLDL、FFAs、FINs、HOMA-IR均显著升高（P<0.05），HDL-C水平均显著下降（P<0.05），见表2。

表212周及14周末两组大鼠血清学指标比较（x-±S）

Tab2Thecomparisonofserummarkersintwogroupsat12weeksand14weeks（x-±S）

注：12周末时，与NC组比较，*P<0.05；14周末时，与NC组比较，△P<0.05。

3．第13周时开始注射STZ：2周内分别测2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d大鼠空腹血糖，模型组与正常对照组相比，血糖值升高（P<0.05），见表3。

表3注射STZ后两周内空腹血糖比较（x-±S）

Tab3ThecomparisonoffastingbloodglucoseafterSTZin2weeks

注：与2d比较，*P<0.05；与NC组比较，△P<0.05。

三、大鼠肝脏组织形态学变化

HE染色光镜下显示NC组大鼠肝组织结构完整，肝小叶结构正常，肝细胞排列紧密成肝索，在中央静脉周围呈放射状分布，肝细胞形态规则，细胞质丰富，细胞核圆形，无肝细胞脂肪变性和炎症细胞浸润，见图1；MC组大鼠肝组织均可见中至重度脂肪肝，多数肝小叶结构轮廓基本消失，肝细胞索模糊，并伴有肝细胞高度气球样变，以大泡性为主的脂肪变性，胞质中有大量脂滴空泡，核居边，严重者胞质疏松呈渔网状改变，界限不清，肝窦狭窄，少数也可见肝细胞碎屑样坏死、炎症细胞浸润和门管区渗出，未见肝纤维化和肝硬化形成，见图2。

图1NC组HE×400图2MC组HE×400

Fig1groupNCHE×400Fig2groupMCHE×400

讨论

随着人们生活方式、饮食习惯的改变，肥胖的发生率逐年增高，与肥胖相关的疾病如糖尿病、高血压、脂肪肝、心脑血管疾病等的发病率不断上升。这些与肥胖相关疾病的发生绝大多数与胰岛素抵抗有关。胰岛素抵抗在非酒精性脂肪肝（NAFLD）发病机制中起着至关重要的作用[2,3]，众所周知，胰岛素抵抗也是2型糖尿病（T2DM）的重要发病机制，由此可见T2DM与NAFLD有着内在的联系。本实验采用高脂高糖饲料喂养12周后大鼠ALT、AST、TG、TC、FINS及HOMA-IR均升高，说明大鼠出现高脂血症，高胰岛素血症和胰岛素抵抗（IR）。IR在脂肪肝发生发展过程中可能起重要作用。研究报道[2-4]，发生IR时，外周脂肪动员增加，血清游离脂肪酸(FFA)增多，肝脏FFA氧化或利用减少，FFA酯化为甘油三酯(TG)增多，肝脏TG释放减少，导致肝细胞脂肪沉积。IR还可刺激微粒体的脂质过氧化酶和抑制线粒体β—氧化而使肝脏易于发生氧化应激。本实验中发现大鼠血中FFA升高，其对于促进脂肪肝的形成有一定作用。

胰岛素抵抗和胰岛素分泌相对不足是T2DM发病中的两个重要因素。

本实验高糖高脂喂养12周后MC组大鼠出现空腹胰岛素水平及HOMA-IR升高，表明模拟出了人类T2DM的部分发病特点，即出现了胰岛素抵抗。STZ是一种广谱抗菌素，具有抗菌和抗肿瘤作用，对动物的胰岛β细胞有高选择性的毒性作用。通过大鼠腹腔注射STZ来制备糖尿病模型现已被广为接受，而STZ注射的剂量大小对于1型糖尿病和2型糖尿病动物模型的制备至关重要：注射较大剂量时，由于STZ直接引起胰岛β细胞的广泛破坏，可制备1糖尿病模型；而注射较小剂量时，由于STZ只破坏部分胰岛β细胞，导致胰岛素相对不足，可制备T2DM模型。本实验在给予高脂高糖饲料喂养使得动物出现肥胖、高胰岛素血症，胰岛素抵抗的基础上，根据文献[1,5]取STZ注射剂量为30mg/kg，注射STZ后，每两天测定一次大鼠空腹血糖，第2d起糖值开始出现升高，并连续监测至满两周，实验发现大鼠空腹血糖在10天左右时达到高值且相对稳定。同时大鼠也出现了不典型的多饮、多尿、多食、消瘦等2型糖尿病症状。当连续两次以上出现FBG≥7.8mmol/L，伴有胰岛素抵抗者视为成功建立了T2DM模型。

在一个动物身上既有高脂喂养导致的肥胖、NAFLD、胰岛素抵抗等；又有小剂量STZ导致部分胰岛β细胞破坏，引起胰岛素相对不足、血糖升高。即模拟出了人类T2DM合并NAFLD的发病过程。

因此，本实验中选用大鼠制备T2DM合并NAFLD动物模型有以下点：1）动物来源广泛，方便饲养，比饲养家兔等动物节省人力及财力；2）造模时间适中，方法简便，价格低廉，重复性好，动物死亡率较低，且较其他造模方法稳定，造模经济效益较高；3）与人类T2DM合并NAFLD症状特征相似，病变有一定的发展过程，可用于药物干预研究。

参考文献

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