革兰氏染色四步法与改良两步法的比较

革兰氏染色四步法与改良两步法的比较

徐斌方传华陈艾萍徐伟红

徐斌方传华陈艾萍徐伟红

（上海市同仁医院检验科200050）

【摘要】目的比较革兰氏染色经典的四步法与改良的两步法在临床微生物检测上的实验效率与性能结果。方法对标准菌株质控品为（G-菌和G+菌）、血培养分级报告阳性标本、痰标本的总计120例样本采用革兰氏染色经典的四步法与改良的两步法进行实验比对，其中血培养阳性标本通过两种革兰氏染色方法一致符合，有28个革兰氏阳性细菌和32个革兰氏阴性细菌。其中痰直接涂片标本通过两种革兰氏染色方法结果有两株细菌在两步法染色判读结果为革兰氏阴性细菌而在四步法染色中结果为革兰氏阳性细菌。结论经统计学分析差异，P>0.05，表明两种血培养瓶的阳性检出率和阴性检出率在统计学上无显著性差异。由此得出结论，革兰染色二步法完全可以替代四步法，操作简易、染色快、效果好，大大缩短了标本处理的时间。

【关键词】革兰氏染色四步法两步法

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）34-0009-01

材料和方法

1材料

1.1标本来源和采集

标准菌株质控品G-菌为大肠埃希氏菌（ATCC29523）、G+菌为金黄色葡萄球菌（ATCC29213），血培养分级报告阳性标本（采用革兰氏染色直接涂片），痰标本，总计120例。

1.2仪器与试剂

显微镜；VITEK2C全自动微生物鉴定药敏分析仪，法国生物梅里埃公司。BASO革兰氏染色液（经典四步法），上海贝沙公司；改良二步法革兰氏染色液250ml*2瓶/套，无锡飞伊生物科技有限公司。

2方法

2.1采用经典四步法革兰氏染色液操作步骤

（1）涂片：取干净的载玻片在涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。针对液体培养基：用接种环沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜。针对固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。

（2）干燥：让涂片在空气中自然干燥。

（3）固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定。

（4）染色：将固定过的涂片初染滴加草酸铵结晶紫液，染1分钟。

（5）水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。

（6）媒染：滴加1滴碘液，染1分钟，水洗。

（7）脱色：吸去残留水，滴加95%乙醇脱色30秒钟至流出液无紫色，立即水洗。

（8）复染：滴加品红复染3分钟，水洗，染色结束。

2.2采用改良二步法革兰氏染色液操作步骤

（1）用四步法中相同方法涂片、干燥、固定。

（2）染色先初染A液结晶紫覆盖整个涂片、染色6秒钟，水洗。

（3）复染水洗干燥后，显微镜下放大100倍、400倍、1000倍观测载玻片上的染色后样本。

2.3细菌的种属鉴定

（1）对革兰氏染色后分类的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌用生理盐水配置成相应的麦氏浓度的菌悬液。

（2）将菌悬液上机VITEK2C用对应的革兰氏阴性菌（GN卡）或革兰氏阳性菌鉴定卡（GP卡）种属鉴定，8～12小时后获得结果以确认与革兰氏染色实验的一致性。

2.4统计学分析对所有实验数据建立表格，两种方法比较采用四格表χ2检验，以P<0.05表明差异有显著性。

结果

从2011年4月至2013年3月共收集了血培养阳性和痰标本各60份。其中血培养阳性标本通过两种革兰氏染色方法结果一致符合，有28个革兰氏阳性细菌和32个革兰氏阴性细菌。其中痰直接涂片标本通过两种革兰氏染色方法结果有两株细菌在两步法染色判读结果为革兰氏阴性细菌而在四步法染色中结果为革兰氏阳性细菌。经统计学分析，χ2=0.015（P>0.05），表明两种血培养瓶的阳性检出率和阴性检出率在统计学上无显著性差异。染色结果见表1。

表1两种革兰氏染色方法对血培养阳性标本和痰标本染色结果的比较

注：两种方法的比较P>0.05

讨论

临床微生物检测作为指导临床抗菌药物正确合理使用中重要的基础环节，其中菌种的分离鉴定又是关键的第一步，只有对微生物准确快速的分类鉴定才能为后续的实验提供可靠的保障，从而为患者的救治提供针对性的抗菌药物。

当前随着我国面临越来越严峻的抗菌药物使用的形势，临床对微生物报告的快速性准确性提出了更高的要求，同时各级医院的微生物检测标本急剧增加，要在有限的实验人手、硬件等条件下，高效、迅捷、准确的处理微生物标本是各个临床微生物实验室所面临的重大课题[1-4]。革兰染色法是细菌学中广泛使用的一种快速有效的分类鉴别方法，1884年由丹麦医师Gram创立，至今已有100多年的历史,其意义在于通过革兰染色法可以将细菌分为两大类:一类被染成紫色,为革兰氏阳性菌(G+);一类被染成红色,为革兰氏阴性菌(Gˉ).根据的原理是G+菌胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，呈紫色。而Gˉ菌肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色[5]。传统革兰染色法为四步法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，但多年来反复实验证明，传统革兰四步染色方法效果不够理想，因此结合当前的实验比对，发现四步法主要问题如下：

（1）Gˉ菌往往由于脱色时间不够，复染时染液浓度过稀且复染时间过短,复染时不被着色而造成假阳性。

（2）传统的四步法的1液中有结晶紫和草酸胺，两者放置长久时会出现结晶沉淀，所以市面上的四步法染液放置的时间一般不能超过半年，四步法媒染步骤中加入了碘液，而碘极容易升华，从而改变溶液浓度，影响染色结果。

（3）脱色中，3液用到了乙醇，而乙醇对结晶紫并没有明显的脱色作用[6]。所以传统四步法的染色原理在实际应用中值得人们进一步的考究。本文采用新型改良的革兰氏染色二步法一改传统四步法，染液中未添加草酸胺、碘，改变了乙醇脱色的方法，在保留了经典的优势后使得染色过程更便捷，其染液稳定，染色时间短（平均10～15秒）。从当前研究实验对比结果来说，两步法与四步法在涂片阳性检出率无统计学差异，差异性主要是可能由于两步法在复染时需严格控制时间，在染液未扩散或干枯前立即水洗，否则染片背景较红。

综上所述，革兰染色二步法完全可以替代四步法，操作简易、染色快、效果好，大大缩短了标本处理的时间，对于大型医院的每天临床微生物标本的处理可明显提高效率，降低差错，是值得临床推广应用。

参考文献

[1]赵舒斌.简易革兰氏染色法及其质量控制[J].宁夏医学杂志.1999,21(3):179.

[2]刘芬，赵韶星.革兰氏染色三步法[J].山西职工医学院学报.2002,12(1):54.

[3]田广文，陈德育，杨祥.微生物学实验教学中革兰氏染色三步法应用试验[J].安徽农学通报.2008,14(15):58-59,66.

[4]李玉玲，于静元，高波.湿片法和革兰氏染色法在判断阴道清洁度的应用与评价[J].当代医学.2009,15(3):59-60.

[5]叶元康.革兰染色的现况和进展[J].中国医药生物技术.2011,06(6):424-425.

[6]王芳，宋瑛琳，田明.革兰氏染色结果的影响因素及原因分析[J].实验室科学.2009(1):104-106.