口腔鳞癌中DCs浸润与VEGF的相关性

口腔鳞癌中DCs浸润与VEGF的相关性

万敏1冯红超2宋宇峰

万敏1冯红超2宋宇峰3

（1遵义市第五人民医院口腔科贵州遵义563000）

（2贵阳市口腔医院口腔外科贵州贵阳550001）

（3贵阳医学院口腔颌面外科贵州贵阳550001）

【摘要】目的：研究口腔鳞癌组织(oralsquamouscellcarcinoma,OSCC)中树突状细胞(DCs)的浸润密度与血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）的表达之间的关系。方法：采用免疫组织化学染色S-P法检测S-100、VEGF的表达情况，进行统计学分析。结果：OSCC中，VEGF表达显著高于正常口腔黏膜组（P=0.000），转移组OSCC组织内VEGF阳性例数明显高于未转移组（P=0.000）；DCs高密度浸润组VEGF阳性表达低于DCs低密度浸润组，两组之间显著差异（P=0.000）。结论：VEGF高表达和DCs浸润密度减少有一定的关系。

【关键词】口腔鳞癌；树突状细胞；血管内皮生长因子

【中图分类号】R730.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2015）06-0010-03

DCsinfiltrationandthecorrelationofVEGFinoralsquamouscellcarcinomas

WanMin.TheFifthPeople'sHospitalofZhunyiCity,GuizhouProvince,Zunyi563000,China;FengHongchao.StomatologicalHospitalinGuiyangcity,GuizhouProvince,Guiyang550001,China;SongYufeng.GuiyangMedicalCollege,GuizhouProvince,Guiyang550001,China

【Abstract】ObjectiveStudyoforalsquamouscarcinomatissuesinfiltratingdendriticcells(DCs)indensityandvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)expressionoftherelationship.MethodsUsingimmunohistochemicalstainingofS-100S-Pmethod,theexpressionofVEGFandstatisticalanalysis.ResultsInOSCC,VEGFexpressionissignificantlyhigherthannormalgroup(P=0.000),oralmucosaOSCCtissuesVEGFpositivecasestransfergroupwasobviouslyhigherthanthatwithoutmetastasisgroup(P=0.000);DCsdenseinfiltrationVEGFpositiveexpressionislowerthantheDCslowdensityinfiltrationgroup,significantdifferencebetweentwogroups(P=0.000).ConclusionsHighVEGFexpressionandDCsinfiltrationdensityhasacertainrelationship.

【Keywords】Oralsquamouscellcarcinomas;Dendriticcells;Vascularendothelialgrowthfactor

国内外研究表明，DCs在肿瘤组织中的浸润程度反映了患者的生存和预后，浸润数量越多，肿瘤分化越好，发生转移越少，生存率越高[1-3]；对肿瘤微环境中免疫状态的了解比外周血免疫功能更能准确反映宿主的抗肿瘤免疫反应[4-5]。DCs在不同成熟阶段有不同表型及功能，肿瘤局部的细胞因子是影响DCs生物学特征的关键因素，这些细胞因子包括转化因子-β（transforminggrowthfactor-β,TGF-β），白介素-10（interleukinIL-10），VEGF等，它们的存在可能是造成DCs表型异常及功能低下的原因。本文采用免疫组化对OSCC中DCs与VEGF的相关性进行初步的研究，报道如下。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1选取2007-2010年来贵阳医学院附属医院口腔颌面外科术前未经化疗、放疗的，并且术后经病理证实的OSCC标本47例。肿瘤细胞分化按照七年制《病理学》教材三级分级法分级，其中分化Ⅰ级29例，Ⅱ级11例，Ⅲ级7例；淋巴结转移27例，其中1例远处转移，无淋巴结转移20例。其中男38例，女9例，年龄38～76岁，平均年龄60岁。全部病例均符合以下条件：①病理学证实为OSCC；②未曾接受手术、放疗、化疗及生物治疗者；③无糖尿病、自身免疫性疾病、造血系统疾病及其他恶性肿瘤；④肝、肾功能正常。对照组为同期收治的口腔正常黏膜组织11例，男性6例，女性5例，年龄36～72岁，平均年龄54岁。

1.1.2主要试剂：

鼠抗人S-100蛋白单克隆抗体（即用型），兔抗人VEGF单克隆抗体（即用型）兔抗人通用型SP系列工作液试剂盒（SP-9000），DAB试剂盒（2瓶装），以上试剂均购自北京中杉金桥公司。

1.2方法

免疫组化染色：经40g/L甲醛固定、石腊包埋的OSCC及口腔正常黏膜标本，5um连续切片，用于HE染色和免疫组化染色S-P法,操作按试剂说明进行，高温高压修复抗原，用PBS替代一抗作阴性对照，阳性对照为已知的OSCC阳性切片。

1.3结果判定

1.3.1DCs计数方法：

在免疫组化染色切片鼠抗人S-100蛋白单克隆抗体标记树突状细胞，S-100阳性为细胞质和细胞核为棕黄色或棕褐色，先在100倍光镜下确定6个密度最高的区域,然后分别在400倍光镜下计数,其平均值分别作为DCs浸润的密度；在OSCC的计数局限于肿瘤及邻近的黏膜和癌周组织[6]。

1.3.2VEGF的表达水平：

在免疫组化染色切片中兔抗人VEGF单克隆抗体标记VEGF，VEGF阳性表达为细胞质黄色至棕褐色，高倍镜下呈颗粒状。VEGF的表达水平采用染色强度评分＋阳性细胞面积的积分表示：染色强度分0－3级；0＝完全阴性，与背景一致；1＝弱阳性,淡黄色略高于背景；2＝阳性，黄色高于背景；3＝强阳性，棕褐色。阳性细胞面积也分4级：0＝阳性细胞面积<10％，1＝阳性细胞面积10％～25％，2＝阳性细胞面积25％～50％，3＝阳性细胞面积>50％。两者相加，0～3为阴性，4～6为阳性表达。

1.4统计学处理

计数资料以mean±SD表示，组间差异用独立样本t检验或非参数检验；计量资料以例数表示，组间差异用卡方检验；所有数据统计均用统计软件SPSS17.0进行处理，检验水准a=0.05，以P<0.05有统计学意义。

2.结果

2.1免疫组化的结果

OSCC邻近组织部分可见密集浸润，部分在基底膜下或癌巢周围则呈带状浸润，形成“防御带”（图1），DCs呈树突状或不规则形状，突起部分可与肿瘤细胞紧密接触；部分散在分布于肿瘤细胞间，部分被癌组织包绕，在某些区域集聚成团，部分病例较少或无。对照组中主要位于基底层，散在分布，多呈椭圆形或不规则形，无明显突起。在OSCC中，DCs浸润密度随病理分级而有差异，Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ级，差异有统计学意义（P=0.030）；无淋巴结转移组内DCs明显高于有淋巴结转移组，差异有统计学意义（P=0.010）。

AB

图1DCs在OSCC中浸润情况（S-P法A×100，B×400）

对照组中，VEGF主要表达于血管内皮细胞上，OSCC组织中VEGF阳性表达于肿瘤细胞、间质细胞胞质内，染色为黄色至棕褐色，弥漫分布，高、中分化鳞癌中阳性染色位于癌巢内，低分化者VEGF棕色颗粒弥漫性分布，在浸润前缘及侵袭性肿瘤细胞团中染色强阳性（图2）。

CD

图2VEGF在OSCC组织中表达(S-P法C×100，D×400)

正常对照组11例口腔黏膜组织中VEGF阳性4例，阳性率36%；OSCC组织中47例，阳性42例，阳性率89%；OSCC组VEGF表达显著高于正常对照组，两组差异有统计学意义（P=0.000）。OSCC中VEGF阳性组转移25例，转移率60%，阴性组转移2例，转移率40%，淋巴结转移组OSCC的VEGF阳性率明显高于无淋巴结转移组（P=0.000）。

2.2OSCC组织中DCs浸润密度与VEGF表达的关系

47例OSCC组织中，DCs为0～45个/HP，中位数15.67，以此为标准分为高密度DCs浸润19例，低密度浸润28例。DCs高密度浸润组VEGF阳性15例，阳性率79%，DCs低密度浸润组VEGF阳性27例，阳性率96%，两组之间显著差异，P=0.000，见表。

表OSCC中DCs浸润密度与VEGF表达的关系

3.讨论

在肿瘤的发生、发展过程中，机体免疫系统通过对肿瘤抗原的识别激活免疫细胞。DCs作为专职APC，是惟一能激活静息型T细胞，诱导和维持初级免疫应答的抗原提呈细胞[7-8]。文献报道，几乎所有的肿瘤都能产生VEGF，并且在肿瘤患者的血清及瘤体内均能检测到异常增高的VEGF，VEGF通过旁分泌途径刺激肿瘤血管内皮增生、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤生长，提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞及内皮细胞浸润，有利于肿瘤基质形成，并使肿瘤细胞侵入新生血管，促进肿瘤转移[9]。

Gabrilovich在1996年对树突状细胞发育分化的研究中发现结肠癌、乳腺癌细胞来源的VEGF影响造血干细胞发育为树突状细胞[10]。Gabrilovich1998年又证实，在造血前体细胞发育过程中，VEGF与其细胞膜上的血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)特异性结合，通过非酪氨酸激酶信号传导途径抑制造血前体细胞中核因子-κB的促转录活性，从而抑制其向功能性的树突状细胞分化，导致DCs的数量和功能下降[6,11]，imDC不能向T细胞递呈抗原，并可诱导T细胞免疫耐受，可能使肿瘤细胞发生免疫逃逸。

本研究中发现：在OSCC中VEGF阳性组中淋巴结转移例数显著高于阴性组（P=0.000）；DCs高密度浸润组VEGF阳性率79%，DCs低密度浸润组VEGF阳性率96%，两组之间显著差异（P=0.000）。胃癌[6]、食管癌[12]、乳腺癌[13]等研究中也表明VEGF的高表达和DCs的浸润呈现负相关，进一步说明VEGF可能参与抑制了DCs的分化和成熟，导致了DCs的浸润密度减少和功能缺陷。

综上所述，本研究结果说明了DCs能在OSCC中起到了一定的抗肿瘤发展、转移的作用，对于预测OSCC的淋巴结转移和预后具有一定的意义。OSCC中高表达VEGF可能是DCs浸润密度减少、成熟障碍导致DCs功能受损的原因之一，进一步研究VEGF导致DCs浸润密度减少及成熟障碍而功能下降的机制，有助于为OSCC针对性治疗提供理论依据。

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