银杏黄酮与阿托伐他汀联合降脂作用的研究

银杏黄酮与阿托伐他汀联合降脂作用的研究

郭敏1乌兰托雅2邬林祥3常绍琴3李树民1

郭敏1乌兰托雅2邬林祥3常绍琴3李树民1李刚1（通讯作者）

（1内蒙古医科大学药学院内蒙古呼和浩特010110）

(2内蒙古自治区人民医院药剂处内蒙古呼和浩特010110)

(3内蒙古元和药业股份有限公司蒙药研究院内蒙古呼和浩特010110)

【摘要】目的探讨银杏黄酮与阿托伐他汀联用对高血脂小鼠的降脂作用。方法选取雄性金黄地鼠随机分配成空白对照组、高脂模型组、银杏黄酮组、阿托伐他汀组、银杏黄酮与阿托伐他汀复方给药组（简称复方给药组）。空白对照组喂养普通饲料，其余各实验组喂养高脂饲料。实验过程中记录小鼠体重变化，给药六周后断头处死分离血清,进行血脂成分总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)的检测。取其肝脏、肾脏及腹主动脉组织，观察肝脏表面的病理改变，并称量肝、肾的重量计算肝、肾指数。将各组织制成石蜡切片，肝、肾组织进行HE染色后在显微镜下观察组织形态变化；腹主动脉组织进行油红Ｏ染色后显微镜下观察组织形态变化，并应用MoticDigilabⅡ-Client图像分析软件测量腹主动脉内膜脂质的厚度，比较不同给药组的腹主动脉内膜的变化。结果①高血脂模型组与空白组比较体重呈现显著的快速增长，复方给药组与模型组比较可以极显著的抑制金黄地鼠体重的增加(P<0.01)。②高脂模型组小鼠血清TC、TG、LDL含量与空白组比较有显著性差异（P＜0.05）。阿托伐他汀组、复方给药组分别与模型组比较血脂各成分均有显著性变化（P＜0.01或0.001）③各给药组肝脏指数与模型组比较无显著差异，与空白组比较有显著的差异（P＜0.05）。各组动物肾脏指数与空白组比较均无显著差异（P＞0.05）。④银杏黄酮单用药组与模型组比较脂质厚度变化不显著（P＞0.05）；阿托伐他汀组和复方给药组分别与模型组比较脂质厚度具有显著性变化（P＜0.05）。结论银杏黄酮与阿托伐他汀复方药物具有明显提高降脂效力的作用。

【关键词】银杏黄酮阿托伐他汀降脂

【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）01-0091-04

高血脂症是指脂肪代谢或运转异常，是血浆中的一种或多种脂质高于正常值而言。TC、TG、LDL-C的升高是动脉粥样硬化的主要危险因素。早期给予强而有效的降脂治疗是阻止粥样斑块进一步发展的重要基础[1]。目前对于高血脂的治疗药物中主要以他汀类药物和贝特酸类药物为主，首选药物为他汀类。他汀类药物能明显降低LDL-C水平，同时可使心血管事件的发生率和死亡率下降约30％。但临床上约有70％的心血管事件不能通过单用他汀药物治疗来预防，特别是对于有混合性高脂血症的高危患者。

银杏为银杏科银杏属植物（GinkgobilobaLinn），又名公孙树，其药用部位主要是叶和果。银杏叶中主要有效成分为黄酮类和萜内酯类，其中银杏黄酮[2]EGB可明显提高高密度脂蛋白（HDL），显著降低血清甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇含量，对高血脂症有一定的治疗和预防的作用。EGB可能通过调整脂蛋白-胆固醇代谢,纠正自由基代谢紊乱,增强抗氧化酶活性等途径发挥调血脂及抗氧化作用[3]。中药降血脂药物具有很多西药所不具备的特点，从血脂异常理论和临床治疗学角度看,联合用药可充分发挥不同药物的互补、协同作用。从而有利于全面调节血脂异常，提高血脂水平的达标率，减少与增大剂量相关的不良反应[4]。本实验通过给金黄地鼠喂食高脂饲料造成高血脂模型，设立不同给药组比较银杏+阿托伐他汀组合的复方药物是否能够提高降血脂的疗效。

1材料与试剂

1.1实验动物

雄性金黄地鼠（级别：SPF级品系：LUG购自：北京维通利华实验动物技术有限公司许可证编号：SCXX（京）2006-0009），饲养于内蒙古大学实验动物中心，自由饮水摄食，24小时明暗交替。

1.2试剂

（CHO）总胆固醇测定试剂盒。（批号：090931.200912）

（TG）甘油三酯测定试剂盒。（批号：093591.200912）

（CK）肌酸激酶测定试剂盒。（批号：110731.201101）

（D-HDL-C）直接高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒。（批号：110261）

（D-LDL-C）直接高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒。（批号：110291）

以上试剂盒均购自中生北控生物科技股份有限公司

油红Ｏ染液(Solarbio)；

苏木精染液（AMRESCO）；

伊红染液（批号：F20100728，国药集团化学试剂有限公司）；

中性树胶（批号：20110104，国药集团化学试剂有限公司）；

石蜡（熔点：60-62°C，上海宏兹实业有限公司）；

1.3实验仪器：低温高速离心机（Sigma型号：3K15）；全自动生化分析仪（爱尔兰蓝宝石型号：ADS6000）；KD-T电脑生物组织摊烤片机（浙江省金华市科迪仪器）；KD202A轮转式切片机（浙江省金华市科迪仪器）；电热恒温干燥箱（MODELSKG-02.500黄石恒丰医疗器械有限公司）；显微镜（Motic型号：BA210）；

2实验方法

2.1高血脂模型分组建立及降血脂药物给药方案

选取SPF级雄性金黄地鼠随机分配成5组每组12只。分别为空白对照组、高脂模型组、银杏黄酮组、阿托伐他汀组、银杏黄酮与阿托伐他汀复方给药组。空白对照组与高脂模型组灌胃蒸馏水，阿托伐他汀组灌胃阿托伐他汀剂量为2.25mg/kg（按临床有效量10mg/kg的1/4，折算成小鼠的给药剂量。）；银杏黄酮组给予银杏黄酮剂量为1.152mg/kg；复方给药组灌胃复方药剂量为2.25mg/kg+1.152mg/kg，所有动物连续饲养，灌胃六周。

2.2体重变化监测

监测动物每天体重变化并记录，各给药组与模型组比较，监测是否有显著差异。

2.3血清TC、TG、HDL、LDL的检测：按照2.1中方法饲养和灌胃六周后，所有金黄地鼠禁食12小时。断头取血，分离血清、使用全自动生化分析仪测定血清中TC、TG、HDL、LDL的含量，具体方法参考试剂盒说明书。比较模型对照组和空白对照组的差异显著性,若两组具有显著差异性则说明高血脂模型建立成功。

2.4各脏器指数的计算：断头取血后取出肝脏、肾脏及腹主动脉组织，称重肝脏并观察肝脏表面形态变化。计算动物肝脏指数、肾脏指数。

2.5肝脏、肾脏、腹主动脉组织石蜡切片的制作

①固定：将灌胃6周的金黄地鼠肝脏、肾脏、腹主动脉组织置于4%的多聚甲醛液中固定。

②脱水：取肝脏一页切成1cm×1cm×（0.3～0.5）cm大小的小块，左肾切取一半，腹主动脉组织上段剪取约3～5mm，将以上组织分别依次浸入70%酒精2h→80%酒→2h→90%酒精2h→95%酒精2h→100%酒精2h。

③透明：将组织浸在纯二甲苯溶液中，更换两次溶液，每次1h。

④浸蜡：将石蜡在恒温箱中熔化后冷凝，反复三次，使其中所含的挥发性物质蒸发，将上述透水透明后的组织浸在65℃熔融的石蜡中过夜。

⑤包埋：包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中，先将熔融的蜡置于蜡杯中，同时将镊子和包埋模具一起放置在恒温箱中预热，然后迅速用预温的镊子夹取组织放置在模具底部，将主动脉横切面当作包埋面的参照面。迅速将蜡杯中熔融的石蜡倒入模具中，冷凝十五分钟后，取出蜡块。

⑥切片：将蜡块固定在切片机上，调整刀片方向到适宜位置，切片厚度调成8μm进行切片，每个样本作三个切片。

⑦贴片：将切片置于35℃水中，用涂有蛋白甘油的载玻片捞片，在60℃的烤片机上烤干，使组织固定在载玻片上，以便于染色和镜检。

2.6染色封片

2.6.1HE染色

①将肝、肾组织石蜡切片分别置于染色架上，于二甲苯Ⅰ中脱蜡5分钟，二甲苯Ⅱ中继续脱蜡5分钟。

②将切片置于100%酒精Ⅰ5分钟→100%酒精Ⅱ5分钟→95%酒精3分钟→90%酒精3分钟→80%酒精3分钟→70%酒精3分钟→蒸馏水3分钟。

③苏木精染液染色10分钟，自来水冲洗玻片多余染液，冲5-10分钟，再到盐酸乙醇分色数秒，镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止。

④自来水冲洗数分钟，1%氨水蓝化，镜检后再自来水冲洗数秒，伊红染液染色2分钟。

⑤切片置于70%酒精数秒→80%酒精数秒→90%酒精数秒→95%酒精3分钟→100%酒精Ⅰ5分钟→100%酒精Ⅱ5分钟。

⑥二甲苯Ⅰ中脱水5分钟，后在二甲苯Ⅱ中脱水5分钟。除去载玻片上多余的水分以后，用甘油明胶封片。

2.6.2油红O染色

①脱蜡：将腹主动脉石蜡切片置于72度的恒温箱中烤片20min,用80度以上的蒸馏水冲洗1min,在更换三次70度左右的热水冲洗。

②染色：将配置好的油红Ｏ染液滴于切片上10min.用6%的异丙醇除去多余的染液，苏木素复染细胞核3min,自来水冲洗10min，盐酸酒精分化3-5s，氨水返蓝5s，自来水冲洗10min.除去载玻片上多余的水分以后，用甘油明胶封片。

2.7显微镜下观察肝、肾、腹主动脉组织切片病理组织学染色结果

分别在10×10倍和10×40倍镜下观察每张切片的肝、肾病理学改变以及腹主动脉内膜层变化，并在10×40倍镜下，测量腹主动脉内壁脂质厚度，取平均值，用μm表示。

2.8数据处理：统计学处理所有实验数据以x-±s表示，采用Microsoft公司Excel2007软件、SPSS13.0软件作进行t检验分析。以P<0.05为差异显著用性标准。

3实验结果

3.1各组药物对于实验动物体重的影响

各组动物随着饲养时间的延长，体重均呈一定程度的增加。高血脂模型组与空白组比较体重呈现显著的快速增长，各给药组金黄地鼠体重由于给药的不同对于体重的影响表现不同的特点，其中银杏黄酮+阿托伐他汀复方给药组与模型组比较可以极显著的抑制金黄地鼠体重的增加(P<0.01)，（结果见表1及图1）。

***P<0.001VS模型组

3.2肝脏形态学观察

各组动物在第6周处死后迅速剥离肝脏进行观察，空白组动物肝脏无明显改变表现为暗红色，具有良好的韧性，模型组肝脏可以发现明显的改变如：质量增加，体积增大，多数肝脏呈现土白色，油性大，同时肝脏具有一点的脆性；各给药组与模型组比较并未见显著的变化。（结果见图2）

图2各实验组肝脏形态观察

A为空白组；B为模型组；C为阿托伐他汀给药组；D为银杏黄酮组;E为银杏黄酮+阿托伐他汀组

3.3各组药物对于实验动物脏器指数影响

对各组动物的肝脏指数和肾脏指数进行计算，实验结果见表2。模型组肝脏指数显著增加，与空白组有显著差异(P<0.05)，以上说明高脂模型建立成功；各给药组肝脏指数与模型组比较无显著差异，与空白组比较有显著的差异。肾脏指数各组动物肾脏指数与空白组比较均无显著差异，结果见标表2。

表2各组动物肝脏指数和肾脏指数变化（x-±s）

#P<0.05VS空白组

3.4降血脂药物对于CHOL、HDL、LDL、TG影响

灌胃六周处死动物后，对各组血脂水平的检测发现，高血脂模型组与空白组比较血清中CHOL、LDL、TG均显著升高（P<0.01）,提示成功建立高血脂动物模型。阿托伐他汀组与模型组比较对于血脂各成分CHOL、LDL、TG的影响显著（P<0.01）,单味银杏黄酮给药组与模型组比较对于血脂各成分CHOL、LDL、TG的影响并不显著（P>0.05）,提示银杏黄酮不具有显著的降低血脂的作用。复方给药组组与模型组比较对于血脂各成分CHOL、LDL、TG具有显著的影响（P<0.05或0.001），提示复方给药组有明显的降血脂作用。结果见表3。

表3动物血清中CHOL、HDL、LDL、TG含量（x-±s）

*P＜0.05，**P＜0.01，**P＜0.001VS模型组；##P＜0.01，###P＜0.001VS空白组

3.5肝组织切片病理组织HE染色结果（见图3）

空白组：肝色暗红、边缘锐利、质韧，肝组织结构正常，肝窦清晰可见，肝索排列整齐，肝细胞无脂肪变性，细胞结构清晰，细胞质丰富，细胞核位于细胞中央。（图A）

模型组：肝组织重度脂肪变性，体积较正常明显增加，肝细胞极度肿胀呈圆形，肝小叶间有单个核细胞浸润。细胞核被细胞内脂肪油滴挤压，肝窦几乎不可见，胞质内充满大量脂肪空泡，界限不清，肝细胞弥漫脂肪性变性呈渔网状。肝细胞完全脂肪化，肝纤化明显，肝脏开始坏死。（图B）

给药组：银杏黄酮组细胞肿胀程度缓减，胞质中小脂泡明显减少。而阿托伐他汀组和银杏黄酮+阿托伐他汀复方给药组，细胞体积恢复正常，肝索排列整，齐规则，胞质中的小脂泡消失。复方给药组效果尤其明显。这些病理改变说明复方给药组可有效降低小鼠血中的血脂成分。（见图C—图E）

图3各组动物肝脏组织病理图片（10×40）

A为空白对照组；B为模型组；C为阿托伐他汀给药组；D为银杏黄酮组;E为银杏黄酮+阿托伐他汀组

3.6各组肾脏组织切片病理学观察结果(图4)

空白组：肾小球结构正常，肾小球包曼氏囊腔清晰.基底膜厚度正常，毛细血管襻开放；肾曲管结构清楚(图A)。

模型组：肾小球呈分叶状，系膜区增宽，基质增多，系膜细胞局部增生，基底膜增厚，肾小球囊壁层增厚。肾组织小叶间动脉和出、入球小动脉玻璃样变且染色颜色加深（图B）。

给药组：银杏黄酮组给药组肾小球呈分叶状，系膜区增宽，基质增多，系膜细胞局部增生，肾小球囊壁层增厚与模型组肾组织无明显差别。证明银杏黄酮单独配方不具有显著降血脂作用。阿托伐他汀组和银杏黄酮+阿托伐他汀复方给药组肾小球呈分叶状，系膜区增宽，基质增多，毛细血管比普遍增厚，可见肾小球部分硬化，间质有散在淋巴细胞浸润，部分肾血管扩张，但其肾脏病理改变较模型组明显减轻，证明银杏黄酮+阿托伐他汀组配方具有一定的降血脂作用。（图C—图E）

图4各组动物肾脏组织病理图片（10×40）

A为空白对照组；B为模型组；C为阿托伐他汀给药组；D为银杏黄酮组;E为银杏黄酮+阿托伐他汀组

3.7各组腹主动脉组织病理学观察结果

3.7.1腹主动脉石蜡切片油红O染色结果（图5）

空白组：腹主动脉内膜薄且较为平滑，无明显脂质沉积，脂质较薄，着色较浅。（图A）

模型组：的内膜较厚且平滑肌细胞排列紊乱，内膜可见大量泡沫细胞堆积，脂质斑块弥漫，脂质明显增厚，血管管腔明显变窄。局部隆起着色较深。（图B）

给药组：银杏组与模型组比较内膜变化不明显，阿托伐他汀组脂质明显变薄，无泡沫细胞堆积，银杏+阿托伐他汀复方组变化最为显著。说明复方药具有显著降低高血脂所致的腹主动脉内膜脂质增厚。（图C、D、E）

图5各组动物腹主动脉病理图片（10×40）

A为空白对照组；B为模型组；C为阿托伐他汀给药组；D为银杏黄酮组;E为银杏黄酮+阿托伐他汀组

3.7.2各组腹主动脉内膜脂质厚度测定结果

模型组腹主动脉内膜脂质厚度与空白组比较具有非常显著性差异（P<0.001），表明高血脂动物模型建立成功。银杏黄酮组与模型组比较无显著性差异（P>0.05）,阿托伐他汀组、银杏黄酮+阿托伐他汀复方给药组与模型组比较有显著性差异（P<0.05、P<0.01），说明长期使用单味药银杏黄酮不具有显著降血脂作用，而使用银杏黄酮+阿托伐他汀复方药具有增加降血脂效力的作用。（结果见表4、图6）

4讨论

正常情况下,除脂肪细胞外其他细胞内一般不见或仅见少量脂滴。在病理状态下如这些细胞中出现脂滴或脂滴明显增多,特别是在肝、肾等实质器官发生脂肪变性时,胞浆内出现大小不一的空泡,这时用脂肪染色来鉴别脂肪变性。

在实验过程中，用HE染色方法并在显微镜下镜检，我们可以观察到模型组小鼠肝细胞索排列紊乱，肝细胞肿胀甚至呈气球样变，胞质充满微小脂泡，细胞核大量消失，与正常肝组织比较体积明显增加，肝脂变程度随高血脂症状的持续而逐渐加重。各给药组细胞体积恢复正常，肝索排列整，齐规则，胞质中的小脂泡消失。这些病理改变说明降血脂药可有效的降低肝组织的血脂成分，但是单方银杏降血脂药对高血脂模型动物肝脏的治疗效果存在不足，比较局限，银杏+阿托伐他汀复方降血脂药物则可以有效地降低肝脏中的血脂成分，为今后降血脂药物的研究奠定了基础。

长期的脂代谢紊乱可以导致过多的脂质在肾脏的异位蓄积，过多聚积的细胞外基质可以导致系膜清除功能障碍，并挤压肾小球毛细血管管腔，造成肾脏结构和功能的损害。对此高血脂模型动物服用不同组方的降血脂药物治疗后，单方银杏组方并没有明显的降血脂作用，而观察复方降血脂药物对高血脂动物模型肾组织的病理影响，见其血脂含量明显降低，根据其病理切片可见肾小球部分肥大、硬化，间质有散在淋巴细胞浸润，部分肾血管扩张，但其肾脏病理改变较模型组明显减轻。这些实验结果均说明银杏+阿托伐他汀复方降血脂药物具有明显的降低血脂作用。

在动脉粥样硬化时,内皮细胞下的脂质沉着,用脂肪染色能将脂质清晰地显示出来。通过对腹主动脉的油红O染色可见内膜较厚且平滑肌细胞排列紊乱，大量泡沫细胞堆积，脂质斑块弥漫，脂质明显增厚，局部隆起着色较深。而给予银杏+阿托伐他汀复方降血脂药物后腹主动脉脂质明显变薄，无泡沫细胞堆积，可见复方药具有显著降低高血脂所致的腹主动脉内膜脂质增厚的作用。

他汀类药物不良反应的发生率与其血药浓度密切相关。药物的剂量、药代动力学特性和药物相互作用等影响血药浓度的因素，都可能影响他汀类药物不良反应的发生[5]。阿托伐他汀与银杏黄酮发挥协同作用的机制有待于进一步研究。本实验中银杏黄酮+阿托伐他汀复方组合的降血脂药物，在减少阿托伐他汀药物剂量的前提下能够产生显著的降脂作用，可避免单一药物长期使用的不良反应。从而达到增效、减毒的功效，从而具有广阔的开发前景，是未来降脂药物研究的重要方向。具有巨大的开发潜力与价值。

参考文献

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[5]由春娜,芮伟,翟所迪.他汀类药物安全性及其在特定疾患者群中的应用[J].世界临床药物,2004,25(10):611-617.

基金项目：国家自然科学基金项目(No.81260650)